研究动态、瞬时、弱相互作用的最佳工具—PL-MS蛋白邻近表达筛选解决方案
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时间：2025-10-11
本公司基于邻近标记技术联合质谱推出PL-MS蛋白邻近表达筛选解决方案，为客户提供从细胞构建培养、亲和富集实验到质谱高通量筛选的一站式服务（阶段可选）。项目交付包括构建细胞系（可选）和结题报告，报告内容涵盖高可信度候选互作蛋白清单、候选互作蛋白注释富集分析、蛋白互作数据库挖掘、蛋白相互作用网络构建、互作网络关键节点筛选以及不同背景条件下互作蛋白结合强弱的动态分析等。
邻近标记（Proximity Labeling, PL）技术是研究细胞内蛋白质相互作用（PPIs）、亚细胞结构等的常用工具。其原理是将标记酶和目标蛋白（Bait）融合表达，通过催化产生高度活泼反应性小分子，原位标记其周围的邻近分子。这些被标记的分子随后可通过亲和纯化和质谱（MS）进行筛选鉴定，从而绘制出目标蛋白在天然细胞环境中的“分子邻里地图”。
不同邻近标记酶的特性决定了其适宜的研究场景，以下总结4种代表性标记酶的选择建议：
弱/动态/瞬时互作
基于邻近标记的特殊原理，可以动态捕获更多弱相互作用和瞬时相互作用的蛋白；
高亲和性
链霉亲和素的亲和效价强，且无需严格保证非变性条件，可以捕获更多膜蛋白的互作；
避免阴性结果
基于质谱定量数据进行无偏见的高通量筛选，可以获得大量蛋白相互作用信息，避免阴性结果；
精准筛选
基于定量差异、蛋白功能注释、互作网络核心节点等多维度分析，提供候选邻近表达蛋白的清单；
原位精准表达
在目的基因N/C端原位插入标记酶，可获得更接近生理状态下的蛋白互作网络。
完整的邻近标记技术联合质谱分析实验包括：①目标序列获取和质粒克隆构建、②基因编辑和细胞系构建、③细胞培养和邻近标记、④生物素标记蛋白的亲和纯化富集、⑤蛋白提取和酶解、⑥质谱检测和⑦数据分析和互作网络构建等步骤。为灵活匹配不同客户需求，本产品提供以下4种服务方案：
方案一：微珠样品服务方案（步骤⑤-⑦）
客户提供亲和富集实验获得的磁性/琼脂糖微珠样品，我司完成MS-ready样本制备、高分辨液质联用系统检测分析、原始数据解析和临近表达蛋白筛选分析。
1.亲和富集后，用无去垢剂的缓冲液或PBS清洗后去上清，以微珠沉淀状态保存和送样。
2.至少1例实验组样品和1例对照组样品；建议每组3次重复。
3.建议每例样品来源于至少5e6细胞（约1个10 cm细胞培养皿）蛋白的富集纯化产物。
方案二：细胞样品服务方案（步骤④-⑦）
客户提供完成邻近标记的细胞样品，我司完成亲和富集实验、MS-ready样本制备、高分辨液质联用系统检测分析、原始数据解析和邻近表达蛋白筛选分析。
1.收集细胞后，以PBS清洗3次，去上清，以细胞沉淀状态保存和送样。
2.至少1例实验组样品和1例对照组样品；建议每组3次重复。
3.建议每例样品至少5e6细胞（约1个10 cm细胞培养皿）。
方案三：质粒样品服务方案（步骤②-⑦）
客户提供包含目标基因序列的质粒样品，我司完成目标蛋白邻近标记标签过表达/原位表达细胞系的构建、细胞培养和邻近标记、亲和富集实验、MS-ready样本制备、高分辨液质联用系统检测分析、原始数据解析和邻近表达蛋白筛选分析。
1.注明准确的NCBI基因名或Uniprot蛋白编号。
2.需提供20 μl以上质粒，浓度大于100 ng/μl，质粒溶于双蒸水中。
3.建议提供目标基因的核酸序列或目标蛋白的氨基酸序列。
方案四：基因/蛋白名服务方案（步骤①-⑦）
客户提供选定的基因名或蛋白名，我司完成目标蛋白核酸序列的分离和克隆、目标蛋白邻近标记标签过表达/原位表达细胞系的构建、细胞培养和邻近标记、亲和富集实验、MS-ready样本制备、高分辨液质联用系统检测分析、原始数据解析和邻近表达蛋白筛选分析。
1.注明准确的NCBI基因名或Uniprot蛋白编号。
2.建议提供明确的细胞系和邻近标签类型；如未指定，将由本公司按物种信息选择默认常规细胞系和邻近标签。
3.建议提供目标基因的核酸序列或目标蛋白的氨基酸序列。
邻近标记串联质谱分析实验流程图
基于定量数据的邻近表达蛋白筛选
在蛋白定量列表中，诱饵蛋白亲和富集样品相比空白对照样品蛋白定量差异上调4倍且P值显著的蛋白被筛选为诱饵蛋白的候选邻近表达蛋白。
互作蛋白筛选结果以火山图展示，并对诱饵蛋白和相互作用最显著的4个互作蛋白进行标注。横坐标表示蛋白在实验组和对照组间的定量差异倍数，纵坐标表示蛋白在实验组和对照组间差异P值。每个点表示一个蛋白，蓝色点表示诱饵蛋白，红色点表示筛选出的互作蛋白，灰色点表示非特异性背景蛋白。
基于此项分析，可选择实验组和对照组间差异倍数和P值排名都靠前的蛋白，进行后续验证和功能探索。
互作蛋白功能注释富集气泡图
对鉴定到的蛋白进行GO和KEGG注释，并以鉴定到的所有蛋白列表作为背景，对筛选出的互作蛋白进行富集分析。结果以气泡图展示，图中每一行代表一个显著富集的注释条目，气泡大小、颜色和横坐标分别表示该注释条目的蛋白数量、富集P值及富集比值。
基于此项分析，可选择富集P值排行前列或较为关注的注释条目中的互作蛋白进行后续验证和功能分析。
STRING蛋白互作数据库信息挖掘
STRING数据库是目前最全面、应用最广泛的蛋白互作数据库。项目报告中会检索STRING数据库中诱饵蛋白的所有已知蛋白相互作用，并对其来源和文献出处进行标注。
基于此项分析，可了解诱饵蛋白相关互作蛋白的研究现状，作为实验结果的补充和参考。
蛋白互作网络图
网络图中心节点为诱饵蛋白，其他每个节点表示一个互作蛋白，连线表示蛋白间存在相互作用。节点形状用于展示蛋白互作信息的来源，即其为本次邻近标记实验鉴定到的，还是STRING数据库中已收录的，或者二者兼有；节点颜色用于展示实验样品与对照样品间蛋白的差异倍数。
关键结果子网路图
基于Cytohubba重要性评分算法从蛋白互作网络中筛选出前20个关键节点蛋白并绘制子网络，其中至少包含4个本次邻近标记实验鉴定到的互作蛋白，颜色表示该蛋白的重要性评分排序。本产品分别使用Degree、DMNC、MCC 3种不同算法对蛋白在互作网络中的重要性进行评分。理论上，在互作网络中重要性较高的蛋白更可能参与靶标蛋白相关的生物功能或信号通路，并在其中发挥更重要的作用。
基于此项分析，可选择重要性评分排名前列的互作蛋白作为更可能具有重要功能的互作蛋白，进行后续验证和功能分析。
注：此处仅展示一种算法网络
蛋白互作动态变化和聚类结果
蛋白之间的相互作用很多时候都是处于动态变化的过程中，有些互作仅在特定条件下出现，而有些互作会随条件变化而发生程度上的改变。若提供至少2个不同实验组和1个对照组，我们还会分析不同条件下蛋白相互作用程度的动态变化。
基于诱饵蛋白和各个互作蛋白在对照组中的定量信号，对互作蛋白在实验组中的定量值进行校正和标准化，计算和评估不同条件下各个互作蛋白与诱饵蛋白的相互作用程度。在不同条件下诱饵蛋白及互作蛋白的互作程度差异，将分别以热图、折线图和韦恩图形式展示。
热图中色块颜色表示互作蛋白在不同分组样品中的定量数据，每一行表示一个互作蛋白。折线图中每一条折线表示一个互作蛋白，横坐标表示不同的比较组，对应不同条件下的蛋白相互作用；纵坐标表示相互作用程度，各个互作蛋白与诱饵蛋白间最强的互作程度校正为1，未发生互作时的互作程度校正为0，并且通过Mfuzz聚类分析，将所有互作蛋白根据其与诱饵蛋白互作程度的变化趋势进行分类，根据折线各个节点的纵坐标变化，反映互作蛋白在不同条件下互作程度的变化。韦恩图中每个圈表示一种分组条件下鉴定到的互作蛋白，重叠区域表示多种条件下均稳定存在的蛋白相互作用。
基于此项分析，可选择不同条件下互作程度变化最大的蛋白，或具有特定变化趋势的蛋白，进行后续验证和功能分析。
总结
PL-MS邻近标记技术克服了传统方法（如IP-MS，pull down等）难以捕捉瞬时/微弱的相互作用的局限性。链霉亲和素的高亲和力、高兼容性可以捕获更多传统方法难以捕获的膜蛋白和不溶性蛋白复合物。原位插入表达可以在接近生理状态下解析蛋白互作网络。
PL-MS蛋白邻近表达筛选解决方案，为客户提供从细胞构建培养、亲和富集实验到质谱高通量筛选的一站式服务。解决方案基于实验筛选保障阳性结果，实验体系成熟数据准确度高，服务整合程度高实验省心，数据结果丰富且可直接用于发表。报告涵盖高可信度候选互作蛋白清单、候选互作蛋白注释富集分析、蛋白互作数据库挖掘、蛋白相互作用网络构建、互作网络关键节点筛选以及不同背景条件下互作蛋白结合强弱的动态分析等。
谱度众合是一家由武汉大学博士团队创办的科研服务企业，我们专注于利用质谱技术服务于生物标志物、药物靶点筛选、基础研究等蛋白质研究领域，我们在本专业细分领域持续深耕十几年，针对具体研究场景开发多种面向具体研究目的和论文发表需求的服务产品，助力于客户更轻松更高效的完成科研目标。
