基于TurboID的邻近标记质谱（PL-MS）实验指南①：TurboID融合表达系统的构建
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时间：2025-10-11
此前我们介绍了蛋白质相互作用筛选实验中常用的IP-MS、PL-MS、Pull down等3种技术的选择策略，以及PL-MS实验中3种标记酶、稳转/瞬转等常见选择的区别，本文我们以CRISPR/Cas9基因编辑技术、TurboID邻近标记方案为例，为研究生提供一套详细、可操作的实验流程。方案将涵盖从POI-TurboID融合表达系统的设计与构建，到稳转细胞系的建立与验证，再到邻近生物素化标记、细胞裂解、链霉亲和素富集以及样品制备用于质谱分析的全过程。
通过遵循本方案，研究者有望高效、准确地鉴定其POI在生理条件下的互作蛋白，为深入理解其生物学功能和相关疾病机制提供关键线索。本方案基于编者文献查询及经验总结，不同课题的POI、细胞等条件不一，本文仅提供实验通用条件起步参考，实际课题应根据实验反馈做方法学优化调整。
TurboID融合表达系统的构建
成功进行TurboID邻近标记实验的前提是构建一个能够稳定、适度表达POI-TurboID融合蛋白的细胞模型。
在设计POI-TurboID融合蛋白时，需要仔细考虑以下两点：
❶融合位置 (N端 vs. C端):将TurboID融合到POI的N端还是C端，取决于POI本身的特性。应综合评估POI已知的N端或C端结构域、功能区 (如酶活性中心、结合位点)、定位信号 (如核定位信号NLS、线粒体导肽MTS) 以及可能的空间位阻效应。理想情况下，融合不应干扰POI的正确折叠、亚细胞定位和生物学功能。查阅相关文献中POI的已知信息或进行小规模预实验探索是明智的选择。
❷Linker序列:在POI和TurboID之间插入一段柔性Linker序列，如(GGGGS)n (n通常为1-3)，有助于减少两者之间的空间位阻，促进各自结构域的正确折叠，并可能提高融合蛋白的稳定性和功能性。
策略一：CRISPR/Cas9介导的内源性POI-TurboID融合
(强烈推荐)
核心优势: 此策略将TurboID编码序列精确整合到细胞基因组中POI的内源性基因座，使得POI-TurboID融合蛋白在内源性启动子和调控元件的控制下表达。这种方式能够维持生理相关的表达水平，避免了过表达可能导致的蛋白质错误定位、聚集、细胞毒性以及非特异性相互作用的增加，从而更真实地反映POI在细胞内的天然互作网络 (Uçkun et al., Bio-protocol 2022)。
01.sgRNA (single guide RNA) 设计与验证
●设计原则：
❶N端融合: 选择紧邻POI基因翻译起始密码子 (ATG) 之后，编码区内的切割位点。
❷C端融合:选择紧邻POI基因翻译终止密码子 (e.g., TAA, TAG, TGA) 之前的切割位点。
❸确保切割位点尽可能靠近期望的TurboID插入位点，以提高同源重组修复 (Homology Directed Repair, HDR) 的效率。
●设计工具：利用常用的在线sgRNA设计工具，如Broad Institute GPP sgRNA Designer, Benchling, CRISPOR等。这些工具通常会提供sgRNA序列、预测的切割效率 (on-target score) 和潜在的脱靶位点 (off-target score)。选择高on-target、低off-target的sgRNA。
●sgRNA验证(可选但推荐): 在正式实验前，可通过体外切割实验 (用纯化的Cas9蛋白和体外转录的sgRNA切割PCR产物) 或在细胞内进行T7核酸内切酶I (T7E1) / Surveyor酶切分析等方法，验证筛选出的sgRNA的实际切割效率。
02.同源重组修复模板 (HDR Donor) 设计与构建
HDR Donor质粒是提供TurboID序列以及用于筛选的元件，并通过同源臂介导其精确插入到Cas9切割位点的模板。
●关键元件：
❶TurboID编码序列: 确保其读码框与POI基因正确连接，避免产生移码突变。
❷亲和标签 (可选):如3xFLAG、HA、V5等，通常融合在TurboID的N端或C端 (不与POI直接接触的一端)，便于后续通过Western Blot检测融合蛋白的表达和分子量，以及通过免疫荧光进行亚细胞定位。
❸筛选标记 (可选但常用):如Puromycin (PuroR)、Neomycin (NeoR) 或Hygromycin B (HygroR) 抗性基因。这些抗性基因通常需要自带独立的启动子 (如PGK或EF1α) 和polyA信号，以便在成功整合后表达，用于筛选阳性细胞克隆。有时也会使用2A自剪切肽序列 (如P2A, T2A) 将抗性基因与TurboID连接，使其在同一转录本上表达但翻译后分离。
❹ 同源臂 (Homology Arms): 位于TurboID (及标签、抗性基因) 序列的两侧，分别与POI基因切割位点上游和下游的基因组序列完全同源。同源臂的长度对HDR效率至关重要，通常单侧长度为500 bp - 1 kb，甚至更长。
●构建方法：通过PCR从已有模板中扩增上述各元件 (POI的上下游同源臂、TurboID序列、标签、抗性基因盒等)，然后利用无缝克隆技术如Gibson Assembly、Golden Gate Assembly或传统的限制性内切酶连接方法，将这些片段组装成完整的HDR Donor质粒。构建完成后，务必通过Sanger测序验证Donor质粒序列的准确性，特别是同源臂和连接区域。 (Cho et al., Nat Protoc 2020 提及了融合构建的设计原则)。
03.Cas9核酸酶表达
Cas9核酸酶负责在sgRNA的引导下切割基因组DNA。
●质粒共转染:将表达Cas9的质粒 (如pX330, lentiCRISPR v2等，后者同时表达sgRNA和Cas9) 与sgRNA表达质粒 (若分开) 和HDR Donor质粒一同转染到靶细胞中。
●核糖核蛋白复合物 (RNP) 转染:将体外纯化的Cas9蛋白与合成或体外转录的sgRNA预先孵育形成RNP复合物，然后与HDR Donor质粒一同导入细胞。RNP的优势在于作用时间短暂，可降低脱靶效应。
●稳定表达Cas9的细胞系:如果实验室有稳定表达Cas9的细胞系，则只需转染sgRNA表达质粒和HDR Donor质粒。
策略二：基于质粒的POI-TurboID过表达系统构建
适用场景: 当CRISPR/Cas9基因编辑在特定细胞系中效率低下、实验周期要求较短以进行快速初步探索、或某些研究确实需要较高表达水平时，可以考虑构建基于质粒的过表达系统。
01.表达载体选择
●骨架:选择带有强效组成型启动子 (如CMV, EF1α) 或诱导型启动子 (如Tet-On/Off系统，可调控表达水平) 的哺乳动物细胞表达载体。
●关键元件:
多克隆位点 (MCS):用于插入POI的编码序列 (CDS)。
预置的TurboID编码序列:许多商业化或Addgene共享的载体已包含TurboID序列，并提供N端或C端融合的选项。
亲和标签:如3xFLAG, V5, Myc等，通常已整合在TurboID序列旁或MCS中。
筛选标记:如Neomycin (G418抗性), Puromycin, Hygromycin B等，用于筛选稳定转染的细胞。
●示例载体:pCMV-TurboID-3×FLAG-Neo 是一个典型的哺乳动物表达载体，包含CMV强启动子驱动POI-TurboID-3xFLAG融合蛋白的表达，并带有Neomycin抗性基因用于筛选稳转细胞系 (来源: Novopro.cn)。
02.POI-TurboID融合基因的克隆
●POI基因获取:通过PCR从cDNA文库、已有的质粒或反转录的总RNA中扩增POI的完整编码区 (CDS)。设计引物时需考虑去除原有的终止密码子 (若进行C端融合) 或起始密码子 (若进行N端融合，且载体已提供起始密码子)。
●克隆方法:
传统酶切连接:利用载体MCS中合适的限制性内切酶位点和POI扩增产物两端引入的相应酶切位点进行酶切和连接。
无缝克隆技术:如Gibson Assembly, In-Fusion Cloning, 或Golden Gate Assembly。这些方法不依赖特定的酶切位点，通过短同源臂介导DNA片段的定向组装，操作更灵活高效。Golden Gate Assembly因其模块化和高通量的特点，在构建复杂质粒时尤其受欢迎 (Cell Reports Methods S2667-2375(24)00183-8; STAR Protocols)。
●序列验证:质粒构建完成后，务必通过Sanger测序验证POI与TurboID的连接是否正确，读码框是否无误，以及POI序列本身有无突变。
本文我学习了TurboID融合表达系统的构建，其中包括基于CRISPR/Cas9技术的内源性POI-TurboID融合表达，和基于质粒的POI-TurboID过表达系统构建，希望对你们也有帮助。由于完整的PL-MS实验指南篇幅过长，我打算分多篇文章发布，接下来我将学习稳转细胞系的建立，包括质粒的转染和单克隆的挑选以及细胞系的验证。另外TurboID邻近标记和亲和富集实验的具体实验步骤以及实验难点和常见解决办法我也将在接下来几篇内容中整理，欢迎持续关注！
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