图1 膜蛋白质组学样品制备方法的选择直接决定结果走向（图形摘要）。来源：Antony F等，Comparative Evaluation of Solid-phase and Membrane Mimetic Strategies in Membrane Proteome Coverage and Disease-State Analysis，Mol Cell Proteomics，2025；https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12858350/

膜蛋白的跨膜结构域（TMD）全是疏水氨基酸，天然状态下被脂质双分子层包着。一旦脱离膜环境，疏水表面直接暴露在水相里，蛋白立刻聚沉。要把蛋白溶出来，去垢剂绕不开——浓度超过临界胶束浓度（CMC）后，去垢剂单体聚成胶束，胶束的疏水核心替代脂双层，把跨膜区包起来，形成“蛋白-去垢剂复合体”，蛋白才保持可溶。

问题在于，去垢剂一边溶膜，一边也在破坏维持三级、四级结构的非共价键。SDS这种强离子型去垢剂提取效率极高，但会直接插进蛋白疏水核心，把所有非共价互作网络打散 —— 做IP-MS用SDS裂解，基本等于提前宣告互作分析失败。

做膜蛋白互作分析，裂解液只能在温和的非离子型或两性离子型去垢剂里选。我们实验室常用的几种对比如下：

表1 常用温和去垢剂参数与IP-MS表现对比

实操上的默认起手式是1% DDM或1% Digitonin裂解。我们做过细菌SpoIIIA膜复合体和拟南芥叶绿体内膜复合体的项目，Digitonin能把这些复合体完整保留下来；换成Triton X-100，互作几乎瞬间解体。所以有客户问“能不能用RIPA裂解做膜蛋白IP”时，我都会先劝一句：RIPA里的Triton X-100和脱氧胆酸钠对膜复合体来说太猛了。

这两年多了一个选项：膜模拟物（membrane mimetics），比如Peptidisc和Nanodisc。它们用两亲性多肽或膜支架蛋白，在无去垢剂或极低去垢剂条件下，把膜蛋白连同结合的内源脂质一起包进盘状结构，蛋白构象和蛋白-脂质互作保留得比胶束体系好得多，下游接MM-TPP或质谱鉴定都没问题。缺点是成本高、通量低，目前我们只对个别关键靶点用它做构象层面的验证，没进常规流程。

去垢剂引起的构象变化到底影不影响IP，第一位的决定因素是抗体表位类型。

线性表位是肽链上连续的一段序列，通常6-12个残基，识别依赖一级结构。就算蛋白变了性，只要这段序列没断，抗体照样结合 —— 所以识别线性表位的抗体不仅能做IP，还能做SDS变性的Western blot。

构象表位正好反过来，它由折叠后三维空间上靠近、但序列上可能相距很远的残基共同构成，构象一变，结合界面就散了。绝大多数有治疗潜力的单抗、识别体内天然膜受体的抗体，靶向的都是构象表位。

这就解释了膜蛋白IP里最常见的翻车现场：客户拿着免疫荧光（IF）里信号很好的抗体来做IP，结果什么都拉不出来。不是抗体坏了，是IF看的是天然构象，而IP裂解液里构象已经变了。

但构象丢失不全是坏事。不少线性表位在天然折叠状态下被埋在疏水核心或互作蛋白底下（表位掩蔽），适度的去垢剂处理让结构松一松，反而把表位暴露出来，IP得率明显上升。我们有个GPCR项目就是这样——调整裂解液配方后，同一个抗体的IP效率翻了数倍。

所以正式开跑之前，预实验省不掉：用选定的裂解体系（比如含特定浓度DDM或Digitonin的缓冲液）裂解后，先跑Native PAGE加Western blot，确认靶蛋白可溶、多聚体状态正常、抗体拉得到。如果可溶但拉不到，基本可以判定表位出了问题，这时候果断换抗体或改提取策略，别在正式实验上烧钱。

很多膜蛋白没有IP级别的单抗，或者现有抗体在去垢剂体系里确实失效。这两条路最实用：

给目标蛋白融合Twin-Strep-tag、FLAG或HA标签再做亲和纯化，是绕开抗体识别障碍的经典策略。Twin-Strep-tag：两个串联的Strep-tag II（WSHPQFEK）通过亲和力（avidity）效应结合工程化链霉亲和素（Strep-Tactin），SPR测的解离常数（Kd）能做到纳摩尔甚至皮摩尔级，低丰度膜受体、易解离的脆弱复合体都拉得住。

有些膜蛋白网络（比如EGFR受体酪氨酸激酶的配体依赖信号转导复合物）太疏水或太动态，温和去垢剂要么溶不出来，要么在长时间孵育中互作网络已经丢了。这种时候用“先固定、后裂解”的思路：裂解前向活细胞培养基加甲醛，在空间距离2.3–2.7 Å的互作蛋白之间形成共价键。甲醛分子小、细胞膜穿透性好，与赖氨酸ε-氨基反应生成羟甲基加合物，脱水成席夫碱，把邻近蛋白交联起来。固定之后可以放心用高浓度Triton X-100甚至适量SDS的RIPA裂解 —— 强去垢剂负责溶膜，共价键负责保互作。甲醛交联可逆，质谱酶解前高温加热就能解交联。

全细胞裂解液里，膜蛋白丰度占比很低，信号被肌动蛋白、核糖体蛋白这类高丰度胞浆蛋白压得死死的。先做一步富集，IP-MS的动态范围和信噪比完全是两个量级。

sulfo-NHS-SS-biotin不能穿膜，只标记活细胞表面蛋白的伯胺（游离N端或赖氨酸侧链），裂解后用链霉亲和素树脂富集——结合极强，可以用严苛洗涤条件冲掉未标记的胞内杂蛋白，最后DTT切断二硫键，把纯化的质膜蛋白释放下来。在这个组分上再做抗体IP，背景能降几个数量级，藏在基线下的低丰度膜受体信号会浮出来。

内膜系统蛋白（内质网、高尔基体、线粒体膜）没法生物素化，就做亚细胞分级：低渗缓冲液加Dounce匀浆器温和破碎细胞，1,200–6,000×g低速离心去掉细胞核和碎片，上清再100,000×g超速离心，沉淀下来的就是粗膜组分。纯物理操作，不引入任何外源化学修饰，先剔掉占大头的可溶胞浆蛋白，之后只需要极少量去垢剂就能溶解——去垢剂总量降下来，构象稳态就好保。

膜蛋白疏水表面积大，在水相里天然“黏”，高丰度背景蛋白、核酸、磁珠表面都可能被非特异吸附。数据端不设控制，结论站不住。

对照设置是底线，两条规则：

用和捕获抗体同宿主、同亚型的IgG（Mouse IgG1、Rabbit IgG这类）做阴性对照，输入等量总蛋白，孵育和洗涤程序完全一致；

用未转染的野生型细胞，或只表达空载体的同基因型细胞做对照，把标签本身和磁珠材质的系统背景减掉。

数据分析方面，我见过太多人还在用“看到核糖体蛋白就删掉”的一刀切方法。这种处理很容易把兼职功能的真实互作蛋白一起误删。现在公认的做法是基于大规模背景数据的概率过滤：

表2 IP-MS数据过滤策略对比

具体操作上，先查CRAPome（公共AP-MS负对照数据库）：角蛋白、HSPs、肌动蛋白这类蛋白丰度高又黏，几乎出现在所有IP产物里，属于“天然背景”。再跑SAINTexpress，它对每个prey蛋白算一个0–1的互作概率评分 —— 综合目标样本中的信号丰度、阴性对照里的出现频率和变异系数 —— 只有通过FDR阈值（一般设<1%或5%）的鉴定才认定是真实互作。

IP洗脱下来的样品还带着去垢剂。ESI源对去垢剂极其敏感，0.01%的Triton X-100、NP-40或SDS就能造成强烈离子抑制，把肽段信号全盖住，还会污染液相色谱柱和质谱仪真空系统。

传统的FASP在膜蛋白上问题不少：蛋白吸附超滤膜、膜孔堵塞、离心时间冗长、肽段回收率低。我们现在的前处理标准流程从这几种里选：

SP3用羧基修饰的顺磁磁珠，酸性加高比例有机溶剂条件下，蛋白靠亲水相互作用（HILIC类似机制）沉淀结合到磁珠上，去垢剂溶于有机溶剂被洗掉，直接在磁珠上加胰酶消化。SP4是升级版，利用有机溶剂诱导蛋白自聚集，连磁珠都不用，难溶性跨膜蛋白的回收率更高。

石英滤膜系统，含5% SDS的裂解液酸化后加甲醇，蛋白在滤膜里形成细微悬浮沉淀，大体积甲醇高速洗掉SDS。比FASP快得多（离心只要几分钟），高难度背景的膜蛋白样本里检出深度更好。

IP下来的膜蛋白复合物往往极微量，任何洗脱转移都有损耗。直接在洗净的免疫磁珠上加尿素（或SDC）轻度变性，加胰酶消化，上清直接收肽段。我们做低丰度互作项目基本都用这个，损耗最小、周期最短。

甲醛在复杂实体组织里容易过度交联，形成致密聚合物网，反而盖住表位、降低提取率。文献报道在小鼠心脏组织里改用乙二醛轻度交联（xIP-MS），释放受磷蛋白PLN及其周边互作网络的效果明显更好，质谱检出深度也更高。我们的经验是：细胞系实验甲醛够用，组织样本先做交联梯度预实验再定浓度。

图2 膜蛋白样品制备七种工作流流程对比：SP3、SP4、FASP、S-Trap、Peptidisc、spNW30、SMA2000。来源：同上文献，Figure 1。

跨膜区酶解是另一个坑。胰蛋白酶是自下而上（bottom-up）蛋白质组学的绝对标准酶，专切赖氨酸和精氨酸的羧基端；但跨膜螺旋恰好极度缺乏这两种碱性氨基酸，胰酶切出来的跨膜肽往往超过40个氨基酸，又长又疏水，反相色谱柱上洗不下来，m/z也超出常规高分辨质谱的最佳检测窗口，成了质谱分析的“隐形盲区”。

如果靶蛋白构象脆弱到温和去垢剂都拉不住完整互作网络，或者互作本身就是转瞬即逝的瞬时接触，还有一个跳出IP框架的方案：邻近标记（BioID、BioID2、TurboID、APEX2）。

原理是把生物素连接酶和靶蛋白融合表达，在活细胞里加生物素底物，酶被激活后产生高活性的生物素-5′-AMP中间体，扩散出去，把半径10–20 nm内所有邻近蛋白的赖氨酸共价生物素化。

BioID需要18–24小时，TurboID只要10分钟。

标记完成之后，裂解完全不用再考虑构象——直接用1–2% SDS的强变性缓冲液加超声，把膜蛋白、细胞骨架彻底溶掉，生物素化的互作蛋白用链霉亲和素拉出来。

图3 邻近标记实验流程总览：靶蛋白融合生物素连接酶，活细胞标记10–20 nm邻近蛋白，链霉亲和素富集后LC-MS分析。来源：Chavez JD等，In-cell labeling and mass spectrometry for systems-level structural biology，Chem Rev，2022，122(8)：7647-7689，Figure 6；https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8966414/

PL-MS在膜蛋白研究上的两个核心价值：

互作“快照”在活细胞里已经被共价键固定，裂解条件随便用；

GPCR、激酶受体和下游接头蛋白那种“碰一下就分开”的信号传递，常规IP在洗涤过程中就丢了，PL能把接触历史积累并记录下来。

代价是它回答的是“邻近”而不是“稳定复合物”，需要和传统IP-MS的结果互相印证。

回到开头的问题：膜蛋白构象丢了，IP-MS还能做吗？——能做，但别指望套用可溶性蛋白的标准IP流程碰运气。

这些年我们沉淀下来的判断顺序大致是：

❶ 评估先行：Native PAGE确认抗体识别的是线性表位还是构象表位；

❷ 构象表位就优化温和去垢剂（DDM、Digitonin），甚至上Peptidisc，或者换Twin-Strep-tag这类高亲和标签；

❸ 互作网络特别脆弱的，先甲醛/乙二醛交联固化；

❹ 上机前做好富集（生物素化或亚细胞分级）、设好IgG/空载体对照，数据用CRAPome加SAINTexpress过滤；

❺ 前处理弃FASP，用SP3/S-Trap/on-bead digestion，跨膜区补Chymotrypsin双酶切；

❻ 实在不行，上TurboID/APEX2邻近标记。

膜蛋白互作组学这几年进展很快，交联化学、标签工程、微量样本前处理和计算过滤都在往前走。“构象丢了就做不了IP-MS”这个说法，早该更新了。

参考资料