核酸-蛋白互作中的相分离研究是近年来生命科学领域的重要研究方向。在过去，更多关注的是分子间的简单结合，但现在我们发现，RNA或DNA与蛋白质之间，其实能够通过多价弱相互作用，巧妙地形成液-液相分离（LLPS）凝聚体。

可别小看这些细胞内的神奇“液滴”，它们在微观世界里大显身手，深度调控着一系列至关重要的生命过程：基因表达与染色质组织的精细调控、RNA代谢及信号转导的高效运转 ， 甚至与众多疾病的发生与发展息息相关。

今天，丸子就给大家深度拆解核酸-蛋白相分离的分子机制，希望给相关领域的研究者们带来课题启发。

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传统观点认为，蛋白质与核酸结合主要依赖：特异性序列识别（如转录因子结合DNA）、RNA结合结构域识别RNA序列、静电作用。

但近年来发现，很多核酸-蛋白互作并不是简单的“一对一结合”，而是通过大量弱、多价、动态的相互作用形成更高级的空间组织结构。常见驱动力包括：

这些区域不仅介导核酸与蛋白的结合，还通过多价相互作用促进蛋白分子之间的交联，形成凝聚网络。核酸，特别是RNA，可以通过与蛋白质IDR的静电相互作用促进LLPS。

许多参与相分离的蛋白含有内在无序区（IDR）或低复杂度区域。IDR在人类蛋白质组中普遍存在，且富集了与疾病相关的突变。

这些区域缺乏稳定三维结构，但能够提供大量弱相互作用位点，是LLPS的重要基础。

核酸在相分离中不仅仅是“被结合的对象”，它们还可以扮演更积极的角色：

研究表明，核酸本身也可以驱动LLPS，其中核苷酸重复序列很可能在这一过程中发挥关键作用。

这是目前研究最为成熟的方向。RNA通过多价结合促进RNA结合蛋白聚集，形成动态的凝聚体。

应激颗粒是细胞在应激条件下于细胞质中形成的无膜细胞器，由翻译受阻的mRNA和RNA结合蛋白组成，帮助细胞维持核糖稳态并响应应激。核心蛋白包括G3BP1、TIA1、FUS和hnRNP家族成员。研究发现，G3BP1作为RNA凝聚器可促进初始RNA-RNA相互作用，而凝聚体的稳定性依赖于RNA-RNA互作来维持。

● 研究问题：某个RNA是否能够促进某个RNA结合蛋白发生相分离？

● 常用技术：RNA Pull-down-MS、RIP-MS、CLIP-seq、ChIRP-MS、RAP-MS

DNA同样可以驱动蛋白凝聚，在染色质组织和基因调控中发挥重要作用。

异染色质蛋白1（HP1）是研究DNA-蛋白相分离的经典模型。HP1通过其染色质结构域识别组蛋白H3K9me2/3修饰，并通过染色质阴影结构域介导二聚化。研究发现，HP1的相分离能力在进化中发生显著变化，裂殖酵母和果蝇的HP1可在小鼠细胞中诱导异染色质凝聚，而小鼠自身HP1则不具备该能力，这与IDR无序程度降低及拮抗旁系同源物的出现有关。此外，端粒RNA（TERRA）可与HP1α形成界面簇，稳定HP1α-DNA凝聚体。

这是近年来极受关注的研究方向。

● 核心模型：超级增强子（SEs）是密集聚集转录机器、转录因子和修饰复合物的基因组调控枢纽。其通过LLPS形成转录凝聚体，协同招募RNA聚合酶II簇以扩增谱系定义基因的表达。代表蛋白包括BRD4、MED1和Pol II CTD。此外，ecDNA携带的超级增强子可招募MED1等因子，通过LLPS形成核凝聚体作为转录枢纽。

● 研究问题：某个转录因子是否通过DNA结合和相分离促进基因激活？

体外重构实验是验证相分离的金标准：

1.纯化目标蛋白和RNA/DNA

2.在合适缓冲体系中共孵育

3.观察液滴形成、融合行为和FRAP恢复

适合已知RNA筛选结合蛋白。例如研究lncRNA X如何调控某疾病通路时，可以用生物素化RNA探针捕获结合蛋白，通过质谱鉴定获得RNA互作蛋白网络。

适合在细胞内研究某条lncRNA在真实染色质环境中结合哪些蛋白。细胞交联后，用生物素化反义寡核苷酸偶联磁珠捕获目标RNA及其结合蛋白，通过质谱鉴定。

近年来，高通量策略的发展极大地推动了相分离蛋白的发现。一种最新发表的Nature Protocols方法结合渗透压缩或TGF-β处理诱导凝聚，再通过蔗糖密度梯度离心和定量质谱，实现内源性生物分子凝聚体和相分离蛋白的系统性高通量鉴定。

HiPPS（高通量蛋白相分离表征技术） 结合LC-MS/MS，可确定分子拥挤剂及多肽对蛋白相分离的促进作用。通过对细胞裂解液中重构相分离液滴的蛋白质组学分析，可系统性鉴定参与相分离的蛋白。

此外，PhaSepDB（https://db.phasep.pro/）是一个综合性的相分离相关蛋白知识库。最新版本PhaSepDB 3.0包含3,484条专家审核条目，涵盖1,849个相分离相关蛋白，提供蛋白介绍、物质状态、相关突变或疾病及相分离相关序列特征分析。

❶ 发现候选RNA/DNA

❷ 预测结合蛋白（可利用PhaSepDB等生物信息学工具）

❸ RNA/DNA Pull-down-MS筛选互作蛋白

❹ 验证关键蛋白结合（可用RIP、CLIP等方法）

❺ 检测蛋白是否形成LLPS（体外重构+FRAP）

❻ 突变IDR/RNA结合区域（功能验证）

❼ 解析相分离调控功能

❽ 关联疾病或生物学过程

在这一路线中，蛋白质组学贯穿始终 —— 从互作蛋白的发现到相分离蛋白的鉴定，再到动态调控网络的解析。

lncRNA作为相分离的“支架”和“分子伴侣”正受到广泛关注，其通过直接结合蛋白调节相分离过程，维持凝聚体稳态。

SLERT通过与DDX21相互作用，促进DDX21相分离并防止其过度聚集和功能丧失。

DNAJC3-AS1结合核仁纤维蛋白FBL，通过其多个结合位点同时与多个FBL分子互作，既促进FBL相分离形成凝聚体，又防止其异常聚集。

位于8q24扩增区的假基因来源lncRNA ZNF252P，通过结合HNRNPK和ILF3并驱动其相分离，在细胞核和细胞质中转录及转录后激活c-Myc，形成正反馈环路促进肿瘤发生。

正常动态凝聚体如何转变为病理性聚集？

ALS中SFPQ剪接发生改变，增加缺乏核定位序列的异构体（altSFPQ）表达，该蛋白相分离潜力降低且结合特性改变。此外，ALS/FTD相关的MATR3突变使其组装体对RNA调控的响应性降低，相关突变破坏蛋白稳定性、相分离和互作网络。

利用RNA序列设计、RNA适配体（RNA aptamer）和工程化蛋白，可以构建人工凝聚体，为理解相分离基本原理和开发合成生物学工具提供新平台。

近年来，研究者开始关注小分子是否诱导或破坏凝聚体，以及药物靶点是否存在凝聚态变化。

相关技术：

针对“核酸-蛋白互作中的相分离研究”，以下技术组合具有较高的实用价值：

如今，核酸-蛋白相分离研究的核心问题正在发生一次全面的思维升级：研究焦点正从传统的“谁和谁结合”转变为，哪些核酸通过什么机制组织蛋白凝聚？形成的凝聚体如何调控生命过程？异常凝聚又如何导致疾病？

对于广大蛋白质组学研究者而言，RNA/DNA Pull-down-MS + 相分离验证 + 定量蛋白质组学是目前极具潜力的切入路线。然而，万事开头难 —— 面对海量的细胞内蛋白，如何高效、高通量地初步筛选出潜在的相分离蛋白，往往是课题启动时面临的第一道技术难关。

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