TPP药物靶点筛选

热蛋白组分析技术（Thermal Proteome Profiling，TPP）是一种基于蛋白质热稳定性变化的原理来研究蛋白质-小分子相互作用、蛋白质功能调控及疾病机制的高通量靶点筛选技术。本公司推出的TPP药物靶点筛选解决方案，包含以下几种实验方案：
经典流程TPP-TR（温度梯度蛋白热位移分析）
通过温度梯度（Temperature Range, TPP-TR）实验，构建蛋白热熔曲线，分析药物处理组与对照组间的蛋白热位移（ΔTm），筛选潜在药物作用靶点。
经典流程TPP-CCR（化合物浓度梯度蛋白热位移分析）

通过化合物浓度梯度（Compound Concentration Range, TPP-CCR）实验，构建蛋白热熔曲线，分析最高浓度药物处理样本与对照样本间发生显著稳定性变化的蛋白，筛选潜在药物作用靶点。
简化流程TPP-ITSA（等温位移分析）

通过等温位移分析（Isothermal Shift Assay, ITSA）实验，比较药物处理组与对照组在单温度刺激下的蛋白变性水平差异（热稳定性变化），筛选潜在药物作用靶点。
简化流程TPP-PISA（蛋白质组积分溶解度改变）

通过蛋白质组积分溶解度改变（Proteome Integral Solubility Alteration, PISA）实验，比较药物处理组与对照组在多个温度刺激下的混合样本的蛋白变性水平差异（热稳定性变化），筛选潜在药物作用靶点。

技术原理

蛋白质在加热过程中会逐渐去折叠（变性），暴露出内部疏水氨基酸残基，进而发生沉淀。配体结合会改变蛋白质的热稳定性，导致其熔解温度（Tm，蛋白发生一半变性沉淀时的温度）发生偏移。需要注意的是，大多数蛋白与配体结合后稳定性提高，表现出正向变化，但也有少数蛋白与配体结合后稳定性降低，表现出负向变化。

进一步地，研究者们发现热位移现象也适用于细胞、组织等复杂体系（图2）。将这一原理与高通量蛋白质检测技术相结合，形成了热蛋白组分析技术（Thermal Proteome Profiling，TPP）。
TPP技术利用高通量质谱系统性检测蛋白质热稳定性变化，用于研究蛋白-配体相互作用、蛋白质复合物形成、翻译后修饰（PTMs）等可影响蛋白热稳定性的生理过程。其核心原理是：蛋白质的热稳定性会因其结合配体或发生修饰而改变，质谱技术可以对蛋白组在每个温度点的变性情况进行定量检测，进而得到所有蛋白在药物作用前后的热稳定性变化，揭示蛋白质功能状态。
在TPP实验中，需要设置药物处理组与溶剂处理对照组，对两组样本进行热处理。对热处理之后的非变性组分（离心上清）进行质谱检测，筛选出组间蛋白定量差异，分析差异蛋白的热稳定性变化，最终确认药物作用靶点（图3）。

然而，传统的TPP存在一些局限性，如需要大量样本、实验处理流程复杂、质谱检测费用高等。为了避免这些问题，研究者开发了简化流程TPP实验——等温位移分析（ITSA）技术和蛋白质组积分溶解度改变（Proteome Integral Solubility Alteration, PISA）技术。
传统TPP技术通过梯度温度热处理检测熔解温度Tm的变化，而ITSA实验聚焦于特定温度下配体对蛋白质的热稳定性影响。如图4所示，在蛋白发生热位移区域的单个温度条件下，药物处理组与对照组样本的可溶性蛋白水平会存在差异，通过比较单个温度处理条件下的蛋白定量差异即可筛选药物作用靶点。PISA技术利用数学中积分的思想，将多个各温度点的样本进行混合，得到一定温度范围内的药物处理组与溶剂对照组的累计蛋白定量差异，避免了温度点选择的偏差。ITSA和PISA技术能减少成本，简化实验处理流程，适合于高通量筛选。

影响蛋白热稳定性的因素除了蛋白-配体相互作用之外，还包括蛋白质翻译后修饰、蛋白-蛋白互作、蛋白异构体等（图5）。对于药物活体处理实验，药物作用会引起靶蛋白及其下游蛋白的代谢功能变化，此时通过TPP实验筛选出的热稳定性变化蛋白可能包括药物直接作用靶点、发生翻译后修饰和互作变化的下游靶点等。而在体外药物处理实验中，由于药物直接对蛋白裂解液进行短时间处理，避免了代谢过程，筛选出的热稳定性变化蛋白更多的是直接的药物作用靶点。