球状蛋白依靠疏水内核形成稳定、单一的三级折叠结构。

维持蛋白天然折叠状态，规避环境扰动造成疏水塌陷、不可逆变性聚集。

生理盐浓度（100–300 mM NaCl）、贴近等电点pH、低温温和环境，严控高盐、强变性剂使用。

FUS、TDP-43等相分离蛋白天然缺乏规整三级结构，IDR/LCD结构域持续发生π-π、阳离子-π多价弱相互作用，生理浓度即可自发发生液液相分离。

依靠空间屏障+化学缓冲抑制分子间交联，拿到单体蛋白；去除保护条件后，蛋白可在生理环境正常重现液滴相变。

两类纯化核心分水岭：常规怕高盐变性，相分离怕低盐抱团。

缓冲液pH贴近蛋白pI（±0.5），生理盐配比，少用强去垢剂；

缓冲液pH偏离蛋白等电点≥1~2个pH单位，避免电荷归零诱发聚集；

难溶型TDP-43裂解添加0.2% Sarkosyl阴离子去垢剂；FUS标准裂解液固定1M NaCl+RNase A，彻底破除RNA-蛋白共凝聚；包涵体来源蛋白直接采用6M盐酸胍/8M尿素全变性溶解。

标签在两类纯化中功能完全不同：

His、FLAG仅作为亲和富集位点，短标签即可满足纯化需求；

●MBP（40.3kDa）：首选标签，依靠庞大球状结构形成空间位阻，封闭低复杂度结构域，大幅抬升蛋白相变临界浓度；

●Twin-Strep：分子量～3kDa，无空间屏蔽效果，但耐受高盐、尿素、强去垢剂，适配变性条件下纯化；

●6×His：仅作为串联辅助标签，单独使用无法抑制IDR聚集。

单用6×His标签纯化FUS、FET家族蛋白，原核表达大概率全部形成包涵体。

微量核酸仅造成紫外读数偏移，常规洗涤即可去除，对蛋白活性影响微弱；

长链RNA充当多价支架，微量核酸即可大幅降低相变临界浓度，蛋白在层析柱内提前液化沉淀，甚至不可逆纤维化。

❶ 裂解后即时添加RNase A/Benzonase广谱核酸酶；

❷ Ni-NTA层析≥20倍柱体积1M NaCl大规模洗杂；

❸ 洗脱质控：A₂₆₀/A₂₈₀控制在0.50~0.71区间。

❶ 常规蛋白：4℃静置过夜酶切，体系无聚集风险；

❷ 相分离蛋白：MBP切除瞬间空间保护消失，极易瞬间相变浑浊，需三种控条件：

❶ 常规蛋白：按理论分子量对应出峰；

❷ 相分离蛋白：无序结构水合半径偏大，表观分子量虚高、易吸附填料，流动相维持200–750mM NaCl+2mM DTT，削弱非特异吸附与巯基氧化交联。

常规蛋白可用普通聚丙烯EP管；相分离蛋白全程使用LoBind低吸附耗材，规避气液/固液界面不可逆吸附损耗；

常规直接A₂₈₀定量；相分离蛋白同步检测A₅₀₀，A₅₀₀＞0即存在纳米级微聚，A₂₈₀读数无效，需变性稀释复测；

常规蛋白添加甘油可反复冻融；相分离蛋白分装单次实验用量，液氮极速冷冻、-80℃保存，仅限单次解冻，严禁反复冻融。

1,6-HD仅可瓦解疏水相互作用驱动的液态凝聚体；针对蛋白-RNA静电交联形成的液滴无溶解效果，高浓度（＞5%）长时间孵育会降低溶液介电常数、增强静电结合，反而促凝；超高浓度1,6-HD会造成非特异性蛋白变性，实验必须设置空白对照组（参考胞内染色质梯度洗脱方案）。

很多初学者混淆字面概念，三类技术无关联：

❶ Triton X-114浊点萃取：依靠去垢剂温度相变分层，膜蛋白专用分离技术，与蛋白自身序列驱动相分离无关；

❷ PEG-葡聚糖双水相（ATPS）：工业级宏观液液萃取工艺，靠两种高分子强制分相，不属于生物大分子内源相分离。

生理条件脱盐后，添加10%–30% PEG8000作为大分子拥挤剂，依靠体积排阻模拟胞内拥挤环境；全程轻柔混匀，剧烈吹打产生的气泡会诱发蛋白非特异固态聚集。

回顾全文，常规球状蛋白纯化的核心是呵护天然折叠，尽量避免变性失活。而相分离蛋白纯化，则更像是在与蛋白的自组装本能“博弈”，努力抑制它们提前发生相变。

对研究者来说，评判一份高质量的相分离蛋白，不仅仅看 SDS-PAGE 上的单一条带。真正的金标准是：去掉 MBP 等保护标签后，蛋白能够在生理盐条件下自发形成微米级动态液滴，并通过荧光漂白恢复（FRAP）实验验证液滴的液态流动性，完整保留原生相分离活性。这也正是大家在实验室里反复验证和追求的目标。