高纯度相分离蛋白获取指南：体外重组表达与纯化体系
所属分类： 技术干货
发布时间： 2026-06-04
概要： 如何获得高纯度单体状态的相分离蛋白？两种主流实验方案解析
研究相分离蛋白，第一步也是最头疼的一步，就是拿到高纯度、有生理活性的单体蛋白。只有这样，我们才能在试管里重构它的相变过程，探究它的生物物理特性。但这类蛋白偏偏富含天然无序区（IDRs），动不动就自己抱团、胡乱聚集。
今天丸子就给大家详细介绍一下体外纯化相分离蛋白的两套核心策略：
1. 基于亲和标签与高盐抑制的“保护性”纯化
2. 针对包涵体的“变性-复性”纯化。
联系丸子，解锁更多小分子靶点筛选、蛋白互作技术干货~
一、核心逻辑：对抗其自发组装的本能
像FUS、TDP-43这类相分离蛋白，它们的生理功能恰恰来源于无序性和多价弱相互作用。换句话说，它们天生就“喜欢”互相勾搭。在体外纯化时，我们必须用分子手段和极端缓冲条件，强行阻断IDRs之间的多价交联，避免不可逆聚集或者跟核酸乱搅在一起。
核心思路就两条：
引入大体积增溶标签（空间位阻）
施加高盐/变性剂（静电屏蔽）
二、基于亲和标签与高盐抑制策略的标准化纯化方案（以FUS为例）
FUS小档案
FUS（Fused in Sarcoma）是研究LLPS及ALS病理的经典模型。它是一种RNA结合蛋白，N端含类朊病毒低复杂度结构域（PrLD），天生容易发生多价互作和相分离。
以下基于Fawzi实验室与Shorter实验室在Nature Protocols及Cell子刊上发表的经典操作方案，整理其体外纯化的标准化流程：
克隆策略
将FUS全长基因克隆至携带N端6xHis-MBP-TEV标签的表达载体。MBP（麦芽糖结合蛋白）的庞大球状结构能提供强大空间位阻，强制隔离FUS粘性PLD区域，将其相分离饱和浓度提升至极高水平。
表达菌株与条件
转化至E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL感受态细胞。
在2x YT培养基中培养至OD600≈0.6，降温至15°C，加入0.5-1.0 mM IPTG诱导16小时。低温诱导可减缓蛋白合成速率，有效避免包涵体形成。
裂解液配方：
50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 M NaCl (或KCl), 10 mM咪唑, 5%甘油, 1.5 mM β-ME, 无EDTA的蛋白酶抑制剂, 以及 5 mg/L RNase A。
操作：
超声破碎后，以23,644 × g离心45分钟获得澄清上清。
关键注意事项：
❶ 1 M超高盐浓度可屏蔽静电相互作用，破坏FUS的RGG结构域与细菌RNA的电荷驱动共凝聚。
❷ RNase A降解RNA支架，两者结合彻底避免核酸污染。
❸ 严禁使用含EDTA的抑制剂：FUS具有锌指结构，EDTA螯合锌离子会导致该结构域不可逆去折叠并引发病理性聚集。
上样与洗涤：
上清液流经Ni-NTA树脂。使用含1 M NaCl和20 mM咪唑的缓冲液进行大规模洗涤（至少20个柱体积），以洗脱非特异性结合的核酸与杂蛋白。
洗脱：
使用含500 mM咪唑的高盐缓冲液洗脱目的蛋白。
质控指标：
最终洗脱液的A260/A280比值应严格控制在0.50-0.71之间，表明核酸已被彻底清除。
流动相：
50 mM Tris (pH 7.4), 200-250 mM NaCl, 5%甘油, 2 mM DTT。
层析柱：
HiLoad 26/60 Superdex 200制备级凝胶过滤柱。
目的：
去除溶液中无法通过超速离心沉降的寡聚体及早期相分离聚集体。收集单一单体洗脱峰。
操作：
将精纯的MBP-FUS稀释至工作浓度（如20 μM），调整缓冲液至生理条件（20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.0）。加入TEV蛋白酶，室温平衡30分钟。
机制：
TEV酶切除MBP标签后，游离FUS瞬间丧失空间位阻保护，溶解度急剧下降，驱动其自发跨越双节点曲线，形成微米级液滴（可借助荧光标签观察）。
三、替代策略：针对包涵体的变性溶解与复性纯化
对于某些全长内在无序蛋白（IDPs），其原核表达极易形成不溶性包涵体。但由于IDPs本身缺乏协同折叠的三级结构，反而适合采用“化学变性-复性”策略。
操作：
离心收集菌体，使用非变性裂解液（含溶菌酶及低浓度去垢剂）裂解细胞并离心，保留富含包涵体的沉淀。用8 M尿素或6 M盐酸胍重悬并彻底溶解包涵体。
优势：
8 M尿素彻底破坏分子内氢键及疏水相互作用，使IDP释放为完全舒展的随机多肽链；同时使内源性蛋白酶失活，避免蛋白水解，且核酸无法维持结合。
操作：
在含有8 M尿素的洗涤缓冲液体系中进行Ni-NTA柱层析，结合与洗脱步骤均维持高浓度变性剂。
结果：
体系处于完全热力学解构状态，杂蛋白变性后丧失非特异性结合能力，产物纯度极高。
操作：
将洗脱的变性蛋白装入透析袋，在递减变性剂浓度的缓冲液（如4 M → 2 M → 0 M尿素，最终平衡于50 mM Tris-HCl, pH 7.4）中逐步透析。
机制：
由于IDPs的天然状态即为柔性无序结构，去除尿素后蛋白会自发恢复其构象系综，重新获得多价结合潜能。
注意事项：
为防止透析中局部浓度过高引发早期相分离聚集，可加入少量EDTA（抑制金属介导断裂）或维持适度盐浓度以模拟细胞内环境。
结语
一句话总结：体外纯化相分离蛋白，本质就是“抑制本能”——用大块头标签、极端离子强度和核酸酶，把蛋白天然自带的相分离驱动力统统拆掉，才能拿到极度纯净的单体去做热力学研究。
下一篇，丸子带大家走进活细胞，聊聊如何从细胞或组织中直接提取内源性相分离复合物，捕捉它们在真实生理状态下的分子网络。敬请期待～
联系丸子，了解更多~
联系丸子，了解更多~
推荐
谱度众合B-isox MS：相分离蛋白初筛首选解决方案
如何高效、无偏地从全蛋白组中锁定真正的相分离候选蛋白？谱度众合B-isox MS一站式高通量筛选服务，依托二十年质谱技术沉淀，实现相分离倾向蛋白的无偏精准鉴定，覆盖从样本处理、蛋白富集到质谱检测的全实验流程，更配套IDR区域预测评分、蛋白互作网络分析等深度数据挖掘服务。
参考文献
1. Alberti S, Saha S, Woodruff JB, Franzmann TM, Wang J, Hyman AA. A User's Guide for Phase Separation Assays with Purified Proteins. *J Mol Biol*. 2018;430(23):4806-4820. doi:10.1016/j.jmb.2018.06.038
2. Pesarrodona M, Latorre I, Salvatella X. Intrinsically Disordered Proteins (IDP): Purification Under Denaturing Conditions. *Methods Mol Biol*. 2022;2406:359-370. doi:10.1007/978-1-0716-1859-2_21
3. Huang Y, Chen J, Hsiung CH, Bai Y, Tan Z, Ye S, Zhang X. Detecting protein-protein interaction during liquid-liquid phase separation using fluorogenic protein sensors. *Mol Biol Cell*. 2024. doi:10.1091/mbc.E24-01-0023
4. Yoshizawa T, Ali R, Jiou J, Fung HYJ, Burke KA, Kim SJ, Lin Y, Peeples WB, Saltzberg D, Soniat M, et al. Nuclear Import Receptor Inhibits Phase Separation of FUS through Binding to Multiple Sites. *Cell*. 2018;173(3):693-705.e22. doi:10.1016/j.cell.2018.03.003
5. Baade I, Hutten S, Sternburg EL, Pörschke M, Hofweber M, Dormann D, Kehlenbach RH. The RNA-binding protein FUS is chaperoned and imported into the nucleus by a network of import receptors. *J Biol Chem*. 2021;296:100659. doi:10.1016/j.jbc.2021.100659
6. Rhine K, Dasovich M, Yoniles J, Badiee M, Skanchy S, Ganser LR, Ge Y, Fare CM, Shorter J, Leung AKL, et al. Poly(ADP-ribose) drives condensation of FUS via a transient interaction. *Mol Cell*. 2022;82(5):969-985.e11. doi:10.1016/j.molcel.2022.01.018
7. Chin JL, Han M, Ganser LR, Wang H, Bhave K, Duran JA, Wuebker E, Shi Z, Shorter J, Myong S, et al. RNA G-quadruplexes function as a tunable structural code to regulate FUS phase separation. *bioRxiv*. Preprint posted online November 1, 2025. doi:10.1101/2025.10.31.685846
8. Chamberlain K. *Purification and preparation of intrinsically disordered proteins for NMR spectroscopy*. Master's Thesis. Purdue University; 2016.
关键词： 高纯度相分离蛋白获取指南：体外重组表达与纯化体系
相关资讯
双喜临门！谱度众合连获2026年“武汉市人工智能企业”和“武汉市大数据企业”双项殊荣
2026-07-30
谱度众合亮相贵州大学溪山生物医药创新论坛：高通量质谱技术驱动药物靶点精准筛选
2026-07-30
科研不容试错，标准铸就信任！谱度众合PRM靶向检测省级团体标准正式获批！
2026-07-30
二十年质谱技术沉淀助力于您的蛋白质研究
谱度众合是一家由武大生科院博士师兄弟创办的科研服务企业，团队延续课题组方向持续深耕专业领域20年，一直专注于利用质谱技术服务于生物标志物发现、药物靶点筛选、分子机制解析等研究领域，致力于为生物医学科研工作者提供靠谱的高效率科研工具。
业务咨询