国自然热点 × 诺奖风向标：相分离研究怎么做？三大技术（TurboID / b-isox / Hi-MS）全解析
所属分类： 技术干货
发布时间： 2026-05-03
概要： 相分离是指一个原本均匀的多组分体系，在外界条件作用下，自发地分离成具有不同组分、结构或物理性质的多个“相”的过程。在生物体内，相分离是细胞内部组织的重要基础，其特指生物大分子自发聚集形成无膜的细胞器或生物分子凝聚体。
相分离是指一个原本均匀的多组分体系，在外界条件作用下，自发地分离成具有不同组分、结构或物理性质的多个“相”的过程。在生物体内，相分离是细胞内部组织的重要基础，其特指生物大分子自发聚集形成无膜的细胞器或生物分子凝聚体。这些生物分子凝聚体多为高度动态、瞬时形成的结构，使用常规的静态法难以捕获相分离蛋白。因此如何高效与准确的富集鉴定相分离蛋白，成为了生物研究中关键的步骤。
相分离蛋白通常含有内在无序区（IDR）、低复杂度序列（LCS），同时带有多价结构域，可形成多点相互作用。相分离蛋白直接的作用多靠多价弱相互作用驱动，例如静电作用、π-π堆积、氢键、疏水作用等。这些特性为相分离蛋白的富集与鉴定提供了策略依据：例如，利用低复杂度无序区域，选特定化学物质捕获进而分离相分离蛋白；利用相分离蛋白之间的弱相互作用，通过破坏这些作用，进而检测蛋白的减少；利用邻近标记技术，将靶蛋白周围的相分离蛋白进行标记等。
代表性技术及其应用
b-isox全称为生物素化异恶唑，该物质可以在小于4℃的环境中形成微晶体。这些微晶体可以作为“种子”，吸引具有低复杂度结构域（LCD）蛋白聚集，随后促进其发生聚合与相分离，之后离心沉淀。
b-isox分子式如下，其中芳香杂环可通过π-π堆积、疏水相互作用与蛋白低复杂度区域结合，诱导无序区形成β结构，进而富集低复杂度蛋白。
实验操作流程往往基于以下步骤：首先裂解细胞与组织样品，获得含有相分离蛋白的裂解液，之后在4℃条件下加入b-isox孵育，富集低复杂度蛋白；离心沉淀，随后对获得的蛋白沉淀进行质谱检测。
文献一：无细胞环境下RNA颗粒的形成：低复杂度序列区域在水凝胶中形成动态纤维
发表年份：2012
期刊名称：Cell
影响因子：42.5
期刊分区：JCR 1区/中科院 1区
内容简介：本文是相分离领域奠基性工作之一，明确了蛋白相分离行为主要依赖低复杂度序列（LC），利用b-isox从多种小鼠和细胞系中沉淀蛋白。本文首先利用b-isox处理人脑以及鼠脑提取物，沉淀相分离组分并测序关联RNA，之后在体外进行无细胞重构验证，纯化LCR蛋白，在体外不同浓度观察到其呈现纤维状与水凝胶动态转换的情况；最后更改浓度、pH、磷酸化等条件调控组装状态。
文献二：利用无细胞系统大规模鉴定植物中的潜在相分离蛋白
发表年份：2023
期刊名称：Molecular plant
影响因子：24.1
期刊分区：JCR 1区/中科院 1区
内容简介：借鉴生物素化异恶唑（b-isox）在动物系统相分离研究中取得的成功，本文研究者创新b-isox在植物中的应用，将b-isox应用于拟南芥，成功鉴定出985个潜在相分离蛋白。首先将拟南芥幼苗/花序组织制备细胞裂解液，之后使用b-isox处理，低速离心分离沉淀进行蛋白质组学检测。在体外验证阶段，利用无细胞表达系统快速合成候选蛋白，加荧光标签后，直接观测液滴形态；随后原核表达并纯化带标签重组蛋白，光学显微镜观察球形液滴，之后使用FRAP检测荧光恢复；构建IDR/LCD缺失/突变体，对比成相能力的变化。
技术原理：TurboID为一种生物素连接酶，可以在活细胞内，对目标蛋白周围10nm范围内的邻近蛋白进行生物素化标记。该方法首先在细胞中，将TurboID酶与目标蛋白融合表达，在ATP和生物素的作用下，TurboID酶快速特异的对邻近蛋白的赖氨酸进行标记；最后通过链霉亲和素磁珠对生物素化的蛋白进行亲和富集。
文献：HERD-1蛋白能够调节多相凝聚物的不相容性，从而调控由小RNA引发的跨代表观遗传
发表年份：2024
期刊名称：Nature Cell Biology
影响因子：19.1
期刊分区：JCR 1区/中科院 1区
内容简介：本文以秀丽隐杆线虫为模型，首次揭示了HERD-1蛋白通过维持生殖颗粒的多相凝聚体不混溶性，精准调控小RNA驱动的跨代表观遗传实现核心机制。线虫生殖颗粒由P颗粒、Z颗粒、M小体组成。本文聚焦于这些亚区室如何实现空间分离（不混溶），通过TurboID鉴定P、Z、M组分，进而筛选获得HERD-1蛋白定位于Z颗粒，之后发现herd-1基因突变的表型，跨代RNAi异常延长，并发生多相凝聚体融合的现象；同时通过体外重构实验，证明了HERD-1可以形成相分离液滴，并阻断Z与P、M颗粒之间的相互作用。
技术原理：首先对细胞进行甲醛交联，固定染色质与相分离凝聚体核心蛋白；之后裂解细胞，保留相分离凝聚体；通过在对照组加入1，6-己二醇，破坏疏水相互作用进而解离相分离蛋白；之后使用限制性内切酶切割DNA；切割后使用生物素寡核苷酸连接DNA末端，使其带上生物素标签；最后使用链霉亲和素磁珠进行富集，质谱分析，含量下降的蛋白即为潜在相分离蛋白。
文献：靶向FOXM1聚集体能够抑制乳腺肿瘤的生长和转移
发表年份：2025
期刊名称：Nature
影响因子：48.5
期刊分区：JCR 1区/中科院 1区
内容简介：FOXM1在乳腺癌中高表达，与增值、转移以及预后差强相关。文章假设FOXM1的相分离是致癌功能的关键基础，通过破坏这一过程进而实现对癌症抑制。首先通过1，6-己二醇处理癌细胞，结合定量蛋白质组学，筛选了对1，6-己二醇敏感的染色质蛋白，证明了FOXM1为最核心的相分离依赖因子；之后通过体外重构与细胞内实验，证明了FOXM1的IDR1固有无序区为相分离发生必须。之后作者探究内源调控机制，筛选表观遗传化合物库，发现AMPK激酶是天然抑制剂，并通过敲除IDR1或过表达磷酸化模拟突变体（Ser376D），显著抑制FOXM1凝聚体形成、致癌转录及细胞增殖/迁移。
总结
综上所述，三种技术各有侧重点。b-isox可无差别富集含LCD/IDR的相分离潜在蛋白，适用于大规模无偏倚筛选；Hi-MS则是利用相分离蛋白之间的疏水相互作用，优势是可靶向疏水作用，区分相分离依赖与非依赖的蛋白；TurboID则擅长活体内空间特异性标记，优势是空间分辨率高，可抓捕瞬时互作。这些方法结合蛋白质组学技术可以实现细胞中相分离蛋白的筛选鉴定，为相分离物质基础及作用机制的研究提供了强有力的支撑。
撰写人：周子旋
审核人：韩强强 肖宇琴
参考文献
1.Kato M, Han TW, Xie S, Shi K, Du X, Wu LC, Mirzaei H, Goldsmith EJ, Longgood J, Pei J, Grishin NV, Frantz DE, Schneider JW, Chen S, Li L, Sawaya MR, Eisenberg D, Tycko R, McKnight SL. Cell-free formation of RNA granules: low complexity sequence domains form dynamic fibers within hydrogels. Cell. 2012 May 11;149(4):753-67. doi: 10.1016/j.cell.2012.04.017. PMID: 22579281; PMCID: PMC6347373.
2.Zhang H, Peng F, He C, Liu Y, Deng H, Fang X. Large-scale identification of potential phase-separation proteins from plants using a cell-free system. Mol Plant. 2023 Feb 6;16(2):310-313. doi: 10.1016/j.molp.2022.11.013. Epub 2022 Nov 25. PMID: 36435966.
3.Zhao C, Cai S, Shi R, Li X, Deng B, Li R, Yang S, Huang J, Liang Y, Lu P, Yuan Z, Jia H, Jiang Z, Zhang X, Kennedy S, Wan G. HERD-1 mediates multiphase condensate immiscibility to regulate small RNA-driven transgenerational epigenetic inheritance. Nat Cell Biol. 2024 Nov;26(11):1958-1970. doi: 10.1038/s41556-024-01514-8. Epub 2024 Oct 1. PMID: 39354132.
4.Xie F, Zhou X, Ran Y, Li R, Zou J, Wan S, Su P, Meng X, Yan H, Lu H, Ru H, Hu H, Mao Z, Yang B, Zhou F, Zhang L. Targeting FOXM1 condensates reduces breast tumour growth and metastasis. Nature. 2025 Feb;638(8052):1112-1121. doi: 10.1038/s41586-024-08421-w. Epub 2025 Jan 15. PMID: 39814884.
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