上一篇，我们先把理论基础和生信初筛讲清楚了，帮大家锁定了那些“看起来很有戏”的蛋白序列。但话说回来，生信预测终究只是“猜”，离“实锤”还差着十万八千里。

为什么必须补上体外实验这一环？道理很简单：细胞里面太乱了。大分子挤成一团，各种互作伙伴、翻译后修饰交织成网。你在显微镜下看到一个荧光亮点，根本没办法判它是真的液态相分离，还是蛋白单纯聚成了一团垃圾？

体外重构实验的逻辑，恰好相反：用还原论的办法，把其他变量统统拿掉——没有拥挤试剂，没有伴侣蛋白，没有复杂的细胞环境。在自己配制的缓冲体系里，看提纯出来的那个蛋白会不会自发形成液滴。如果能，这就不是什么“相关性”，而是最核心的因果证据。今天我们继续完整拆解体外相分离实验的全流程，主要包括四个环节：

(1) 重组蛋白的表达与纯化——怎么做才能拿到“干净、能用”的蛋白

(2) 相分离的诱导条件摸索——盐、浓度、crowding agent，怎么调

(3) 液滴特性表征——DIC形态、FRAP流动性、浊度法定量

(4) 相图构建——测C_sat，画出真正的相边界

每一步，我都会讲清楚操作要点和判定标准。做好准备，咱们进实验室。

联系丸子，解锁更多小分子靶点筛选、蛋白互作技术干货~

做体外重构，第一步就是拿到高质量的重组蛋白。但相分离蛋白自组装和聚集倾向极强，如果蛋白制备这个环节出了问题，后面所有的实验结果都不可信。

优先选择带有强促溶标签的表达载体，比如GST、MBP标签，能显著降低蛋白在表达过程中形成包涵体的概率；同时别忘了在标签与目标序列之间加上特异性蛋白酶酶切位点，后面是要切掉的。

注意大分子量的折叠标签会闹出大问题！以GST（26kDa）为例，它会产生严重的空间位阻，直接干扰IDR之间的弱多价相互作用。所以最终的相分离实验，一定要用切除标签后的"裸蛋白"来做。如果你需要荧光标记，也请在切完标签之后再用小分子荧光染料去偶联。

将重组质粒转化进BL21（DE3）感受态后，记住一个原则：低、慢、冷。

在低OD值（OD₆₀₀=0.3–0.6）时加入低浓度IPTG（0.2mM及以下），然后在16–18°C的低温环境下慢慢诱导过夜。

低温慢诱导能让新生肽链有充足的时间正确折叠，最大程度减少错误折叠和非特异性沉淀。

相分离蛋白的溶解度对盐浓度、pH值极度敏感，裂解与纯化缓冲液需满足以下核心要求：

● 采用中性pH体系（如20mM Tris-HCl，pH 7.4），避免pH偏离生理范围导致蛋白变性；

● 加入高浓度NaCl（500mM及以上），通过屏蔽静电相互作用抑制蛋白在纯化过程中发生过早相分离或聚集；

● 加入10%甘油稳定蛋白结构，新鲜添加蛋白酶抑制剂、还原剂（β-巯基乙醇或DTT），防止蛋白降解与二硫键错配。

● 亲和层析抓到目标蛋白后，直接在树脂上进行原位酶切，4°C旋转孵育至少4小时，确保标签彻底切干净。

● 洗脱后的蛋白要通过SDS-PAGE验证纯度（纯度要达到95%以上），同时用动态光散射（DLS）检查蛋白有没有预先聚集 —— 必须确认蛋白以单体形式存在后，再分装冻存于-80°C，而且尽量避免反复冻融。

蛋白准备好了，接下来就是找条件——摸索能让你的蛋白发生相分离的临界条件。

生理状态下，细胞内是大分子高度拥挤的环境，总浓度可达200–400mg/mL。而在体外，你的蛋白浓度通常只在微摩尔级别，差了好几个数量级。

所以需要通过以下手段来"模拟"胞内的拥挤环境，诱导相分离发生：

最常用的诱导方式，优先选择PEG-8000、Dextran、Ficoll等惰性拥挤试剂，终浓度通常为5%-15%，通过体积排阻效应提升蛋白的有效浓度，驱动相分离发生；

通过降低体系中的NaCl浓度，增强蛋白间的静电相互作用，是调控相分离的核心变量，通常设置50-500mM的NaCl浓度梯度；

相分离存在明确的饱和浓度阈值，需设置5-50μM的蛋白终浓度梯度，明确临界浓度；

pH值、温度、RNA/核酸等互作分子、蛋白翻译后修饰，均可显著影响相分离行为，需根据目标蛋白的生物学特性针对性设置梯度。

当蛋白溶液发生相分离时，浓相液滴的形成会导致光散射显著增加，表现为OD₃₄₀或OD₆₀₀处吸光度的上升，这是浊度法的核心原理，也是体外相分离最快速的初筛方法。

❶ 在96孔板中设置不同条件的反应体系，总体系通常为100-200μL，每个条件设置3个复孔，同时设置空白缓冲液对照与阴性对照蛋白；

❷ 轻柔混匀体系后，37℃孵育5-10分钟，使用酶标仪检测340nm或600nm处的吸光度值；

❸ 以蛋白浓度、盐浓度、拥挤试剂浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制相分离诱导曲线，明确临界诱导条件。

通过浊度法完成初筛后，必须通过多维度的实验表征，验证体系中形成的是相分离液态液滴，而非固态蛋白聚集体，这是体外实验的核心判定环节。

浊度法只告诉你"散射增加了"，而DIC显微镜能让你亲眼看到液滴长什么样、有什么动态行为——这是判断相分离最核心的形态学依据。

❶ 将孵育后的相分离反应体系滴加到载玻片或玻璃底培养皿上，加盖盖玻片，避免产生气泡；

❷ 在DIC模式下，使用40倍及以上的物镜观察，记录不同时间点的图像，重点观察液滴的形态与动态行为。

● 形态规则，呈完美球形：这是液滴最小化表面张力的热力学必然结果，尺寸通常在0.5–20μm；

● 能融合：两个液滴接触后，会在极短时间内自发融合成一个更大的球形液滴，如果能拍到融合过程的视频，那是液态特性的铁证；

● 能润湿：液滴碰到玻片等固体边界时，会浸润铺展成半球状，而不是像刚性球一样弹开。

光漂白后荧光恢复实验，是验证液滴内部分子动态性与液态属性的核心手段，可直接区分液态液滴、凝胶与固态聚集体。

❶ 将荧光标记的目标蛋白纳入相分离体系，制备显微观察样本；

❷ 在共聚焦显微镜下，选择形态规则的球形液滴，用高强度激光漂白其中一小块区域，然后以固定时间间隔连续成像，记录漂白区域的荧光恢复过程，一直拍到恢复进入平台期为止。

● 液态液滴的核心特征：漂白区的荧光在数秒到数十秒内快速且几乎完全恢复，说明液滴内部的分子具有高度流动性，能快速交换；

● 两个关键定量参数：

❶ 移动分数：恢复到平台期时的荧光强度占初始强度的比例。纯液态液滴的移动分数通常>70%；如果<30%，不能认定为液态相分离；

❷ 恢复半衰期：荧光恢复到可恢复最大值50%所需的时间，直接反映分子扩散速率，液态液滴通常在秒级。

● 仅凭荧光恢复不足以作为相分离的诊断依据，非特异性聚集也可能出现类似的恢复模式，必须结合DIC显微镜的形态与融合证据综合判断；

● FRAP分析的模型选择对结果影响极大，不当的模型假设会显著误导扩散系数的估算，需根据液滴的大小、漂白区域的几何构型选择适配的数学模型；

● 需设置液滴外的弥散区域作为对照，排除光漂白对荧光基团的不可逆损伤。

看到液滴是定性结果，而要精准界定相分离这一热力学过程，必须通过离心沉降实验测定饱和浓度并构建完整的相图。

饱和浓度（C_sat）是相分离的核心热力学参数。蛋白浓度低于C_sat时，体系是均一的单相；一旦超过C_sat，体系自发分成浓相和稀相，而稀相的蛋白浓度始终维持在C_sat。测定不同条件下的C_sat，就能绘制出区分单相区和两相区的双节点曲线——也就是相图。

❶ 配置不同条件的相分离反应体系，孵育至相分离平衡后，高速离心（通常16000×g，10分钟）使浓相与稀相分离；

❷ 分别收集上清液（稀相）与沉淀（浓相），通过BCA、分光光度法或SDS-PAGE定量测定两相的蛋白浓度；

❸ 稀相的蛋白浓度即为该条件下的C_sat，通过改变蛋白浓度、盐浓度、温度、拥挤试剂浓度等参数，获得一系列相变点，拟合绘制完整的相图。

固态聚集体在显微镜下也可能呈现点状信号，但其核心区别是：无规则球形形态、不发生融合、FRAP荧光几乎不恢复。必须同时满足“球形形态+融合行为+快速FRAP恢复”三大核心特征，才能判定为液态相分离。

如果没看到相分离，按以下优先级排查：

● 蛋白是不是降解了或者预先聚集了？重新做蛋白制备和质控；

● 体系盐浓度是不是太高了？逐步降低NaCl浓度，增强分子间相互作用；

● 拥挤试剂浓度是不是不够？提高PEG-8000等试剂的终浓度；

● 你的蛋白是不是需要"伙伴" —— 比如RNA、伴侣蛋白，才能驱动相分离？把对应的互作分子补进去；

● 是不是需要特定翻译后修饰？用体外修饰体系先把蛋白修饰好再去做实验。

所有实验必须设置严格的阴性对照，包括单独的标签蛋白、已证实无相分离能力的球状蛋白，在完全相同的条件下进行测试，排除缓冲体系、标签、荧光染料等因素导致的假阳性结果。

好了，到这里，体外重构实验这一块就基本讲清楚了。咱们快速回顾一下核心逻辑：

从高纯度蛋白制备，到相分离条件的系统筛选，再到液滴形态、流动性、饱和浓度的多维表征，最终构建出完整的相图——这一整套流程做下来，你就能非常扎实地回答一个问题：我的蛋白，到底有没有“内在”的相分离能力？这是整个相分离研究中最不可动摇的硬证据，也是后续所有细胞实验和功能研究的基础。

那下一步呢？当然是从试管里走出来，回到活细胞中。毕竟，体外能分，不代表细胞内真会分；细胞内分了，也不代表它真的有功能。下一篇，我们就来重点讲：

● 活细胞成像与胞内FRAP怎么做、怎么判；

● 1,6-己二醇到底该怎么用；

● 光遗传学工具如何帮你实现“指哪打哪”的相分离操控；

从试管到细胞，一步一个脚印。下一篇见。

参考文献