目的蛋白是一个修饰酶，应该怎么找对应的底物？两条靶点挖掘路径让你明确信号网络
所属分类： 技术干货
发布时间： 2026-04-20
概要： 我的目的蛋白是个修饰酶，怎么找到它到底修饰了谁？今天我们将系统梳理两条主流策略—— 基于互作蛋白的筛选和基于修饰组学的鉴定，并从“可落地”的角度，为大家提供一套完整的技术路线图。
蛋白翻译后修饰是细胞信号网络的核心调控方式，修饰酶作为修饰反应的催化核心，其底物谱的解析是阐明酶生物学功能、挖掘疾病靶点的必经之路。
在实验体系中，修饰酶与底物常存在瞬时互作、低丰度结合、位点特异性调控三大难点，传统低通量验证已无法满足研究需求。
结合全球主流数据库的标准化方案与高分文献策略，目前学界公认两大可落地的底物筛选路径：一是基于蛋白质物理结合的互作蛋白筛选；二是基于高分辨质谱的定量蛋白质翻译后修饰组学分析。今天我将系统梳理这两条主流策略、并从“可落地”的角度，为大家提供一套完整的技术路线图。
联系丸子，解锁更多小分子靶点筛选、蛋白互作技术干货~
一、两大主流策略
如果能在细胞内直接“抓到”修饰酶与底物的复合物，底物鉴定就有了物理证据。这条路径的核心逻辑就是“钓出修饰酶的相互作用伙伴”。不过，直接钓和间接钓各有门道。
策略A：直接“拉下来”—— IP-MS
这是最经典的策略。用抗体或标签将修饰酶从细胞裂解液中免疫沉淀下来，连带着它的结合蛋白一起“拽”出来，然后用质谱鉴定这些共沉淀的蛋白。
● 适用场景：修饰酶与底物有较强的、相对稳定的结合（如E3泛素连接酶与底物的识别）。
● 局限：瞬时相互作用的底物极易丢失；背景蛋白多，假阳性率高。
策略B：标记“邻居”—— 邻近标记技术
如果酶与底物只是“擦肩而过”，那与其强行去拉，不如让修饰酶主动给周围的蛋白贴上标签。
BioID的原理正是将一种改造过的生物素连接酶（如BirA*）融合到目的修饰酶上，这个融合酶会在活细胞内将周围~10 nm范围内的蛋白生物素化。之后用链霉亲和素磁珠富集所有被生物素标记的蛋白，质谱一鉴便知。
相比传统Co-IP，BioID有几大优势：
❶ 能捕获瞬时的、甚至物理上并不直接结合的“邻近”蛋白。
❷ 在活细胞原位操作，更接近生理状态。
❸ 通过控制表达时间和生物素处理时间，可以实现时间分辨的互作图谱。
近年来，TurboID作为BioID的升级版本，标记速度大幅提升（从数小时缩短至10分钟），更适合动态过程的捕捉。这条路径对膜蛋白、细胞器定位蛋白尤为友好。
策略C：底物陷阱 —— 专门为水解酶设计
对于蛋白酶、去泛素化酶、磷酸酶这类“切割型”或“去修饰型”的酶，常规Co-IP面临一个特殊难题：酶一旦碰到底物就会将其切开并释放，复合物转瞬即逝。
底物陷阱策略的核心是：构建催化失活的酶突变体，这个突变体仍然能识别并结合底物，但“切不动”—— 从而让底物被稳定捕获在酶的活性位点上。比如，用底物陷阱突变体鉴定酵母Cdc14磷酸酶的直接靶标，已成为经典范例。
更前沿的做法是利用遗传密码扩展技术在酶的催化残基中引入非天然氨基酸DAP（2,3-二氨基丙酸），使其能在光激活条件下不可逆地捕获底物。2024年Nature Protocols已发表该方法的详细指南，适用于丝氨酸/半胱氨酸水解酶在活细胞中的底物捕获。
如果目的蛋白是一个修饰酶（如乙酰转移酶、甲基转移酶、泛素连接酶等），事情就变得非常直接：去比较“有酶”和“没酶”的条件下，全局蛋白质修饰谱的变化。这本质上是在做减法实验——缺失了什么修饰，很可能就是什么底物。
1.为什么要走这条路？
相比路径一，路径二有几个独特优势：
不需要猜测酶与底物是否物理结合，直接看修饰结果。
实验设计灵活：可以是酶过表达 vs 对照，也可以是敲除/敲降 vs 对照，还可以是不同处理/时间点之间的比较。
结果是“修饰差异的蛋白列表+具体的修饰位点”，信息量更大，为后续功能验证提供精确坐标。
2.通用实验流程
第一步：样本设计。至少要有一个实验组和一个对照组，如果条件允许，建议设计多个生物学重复（n≥3）以保证统计效力。
第二步：修饰肽段的富集。这是最关键的环节。
不同PTM有不同的富集策略：
磷酸化：TiO2或IMAC（固相金属亲和层析）
乙酰化：抗乙酰赖氨酸抗体免疫富集
泛素化：抗K-ε-GG抗体富集（胰酶消化后留下的双甘氨酸标签）
甲基化：抗甲基化抗体
SUMO化：抗SUMO抗体
第三步：LC-MS/MS质谱数据采集。建议采用DIA（数据非依赖采集）或TMT标记的DDA模式，以提高定量准确性和覆盖深度。
第四步：数据分析与候选底物筛选。重点关注实验组相比对照组显著下调的修饰位点—— 这些位点所对应的蛋白即为候选底物。常用分析软件包括MaxQuant、Spectronaut、Skyline等。
3.不同修饰类型的差异化解法
不同PTM需要不同的处理方式，这里简要列举几种常见修饰酶的研究思路：
❶ 泛素连接酶（E3）：除了直接富集泛素化肽段，还可以使用“正交泛素转移”策略。将E3与一个仅识别非天然泛素（xUB）的E2配对，这样E3只能将xUB转移到其底物上，随后通过xUB的特异性富集即可精准识别底物，有效规避了内源泛素化信号的干扰。2018年Science Advances上Bhuripanyo等人正是用此法鉴定了E4B和CHIP的数百个底物。
❷ 去泛素化酶（DUB）：去泛素化酶的作用是“去掉”底物上的泛素链，因此修饰组学中的信号是“丢失”。思路类似：敲除或抑制DUB后，泛素化水平升高的蛋白可能是其底物。
❸ 乙酰转移酶/去乙酰化酶：用抗乙酰赖氨酸抗体富集乙酰化肽段，比较酶活性改变前后的乙酰化差异谱。
❹ 甲基转移酶/去甲基化酶：富集策略类似，但甲基化修饰有单甲基、二甲基、三甲基之分，需要对应级别的抗体。
二、比较与选择：两大路径的适用边界
选择建议：
如果修饰酶的功能尚不明确，先做互作蛋白筛选（特别是BioID），拿到一份“候选名单”再往下走。
如果修饰酶的功能明确（比如已知它是一个乙酰转移酶），直接上修饰组学，一步到位看修饰差异。
如果资源和条件允许，两条路径并行是最佳方案 —— 互作数据与修饰数据交叉验证，可信度大幅提升。
三、从候选到确认：底物验证的黄金标准
无论走哪条路，最终都会得到一份“候选底物列表”。但候选不等于真底物，必须经过层层验证才能确认。
在纯化体系中混合纯化的修饰酶、候选底物蛋白以及必要的辅因子（如ATP、乙酰辅酶A、SAM等），通过Western blot或质谱检测底物是否被修饰。这一步排除了细胞中其他因素的干扰，是确认“直接底物”的关键。
在细胞内过表达或敲低修饰酶，用免疫沉淀富集候选底物蛋白，再用位点特异性抗体检测其修饰水平是否随之改变。如果靶蛋白的修饰水平与酶的表达量呈正相关（对于修饰酶）或负相关（对于去修饰酶），则进一步支持其作为底物的身份。
如果修饰组学已经给出了具体的修饰位点，将这个位点（赖氨酸/丝氨酸/苏氨酸等）突变为不能被修饰的氨基酸（如赖氨酸突变为精氨酸），再检测修饰信号是否消失，这是确认该位点是修饰酶靶点的最直接证据。
底物修饰的生物学意义是什么？这可能涉及细胞定位改变、蛋白稳定性改变、酶活性改变、蛋白-蛋白互作改变等。设计相应的功能实验，将修饰事件与表型关联起来，才是故事的终点。
结语
寻找修饰酶的底物，没有“一键式”解决方案，但有一张清晰的方法学地图。
互作蛋白筛选告诉你“谁和谁在一起”，修饰组学告诉你“谁被谁修饰了”—— 两条路各有千秋，也各有限制。
对于大多数修饰酶研究而言，先通过修饰组学或BioID锁定候选名单，再用体外和细胞实验逐层验证，最后结合计算预测扩展网络，是一条稳健、高效、可复现的技术路线。
希望这份指南能为你的课题提供切实可行的参考。毕竟，找到一个好的底物，往往就是一个好故事的开始。
联系丸子，了解更多~
推荐
谱度众合：最成本可控、结果有保障的蛋白修饰研究策略——目的蛋白修饰鉴定
蛋白质翻译后修饰是机制研究的“深水区”，天然修饰丰度往往很低需要经过富集才能高效研究，很多研究者认为研究修饰必然涉及成本较高的修饰基团富集，针对有明确通路或目的蛋白的场景，富集目的蛋白是一种成本更低、结果更可控的实验策略。
谱度众合推出目的蛋白修饰鉴定分析。可支持UNIMOD收录1000+修饰类型及自定义修饰基团，一次检测可同时分析多种修饰类型。可基于同位点非修饰肽段为基准计算每个位点的修饰程度，比较不同刺激条件下修饰程度的变化。同时我们配备行业领先的高性能质谱和专研的修饰高灵敏度质谱检测方法，配备评估修饰检测效能的质控体系及经验丰富的技术支持全程指导目的位点的检出。
✔ 常见修饰鉴定：支持UNIMOD收录1000+修饰类型，支持在一次检测中同时分析多种修饰类型。
✔ 自定义修饰鉴定：可自主定义修饰基团，支持自有化合物与药物靶点共价结合的结合位点发现。
✔ OpenSearch未知修饰鉴定：支持OpenSearch开放搜索，发现未知修饰类型及其位点鉴定。
联系丸子，了解更多~
推荐
谱度众合：最成本可控、结果有保障的蛋白修饰研究策略——目的蛋白修饰鉴定
蛋白质翻译后修饰是机制研究的“深水区”，天然修饰丰度往往很低需要经过富集才能高效研究，很多研究者认为研究修饰必然涉及成本较高的修饰基团富集，针对有明确通路或目的蛋白的场景，富集目的蛋白是一种成本更低、结果更可控的实验策略。
谱度众合推出目的蛋白修饰鉴定分析。可支持UNIMOD收录1000+修饰类型及自定义修饰基团，一次检测可同时分析多种修饰类型。可基于同位点非修饰肽段为基准计算每个位点的修饰程度，比较不同刺激条件下修饰程度的变化。同时我们配备行业领先的高性能质谱和专研的修饰高灵敏度质谱检测方法，配备评估修饰检测效能的质控体系及经验丰富的技术支持全程指导目的位点的检出。
✔ 常见修饰鉴定：支持UNIMOD收录1000+修饰类型，支持在一次检测中同时分析多种修饰类型。
✔ 自定义修饰鉴定：可自主定义修饰基团，支持自有化合物与药物靶点共价结合的结合位点发现。
✔ OpenSearch未知修饰鉴定：支持OpenSearch开放搜索，发现未知修饰类型及其位点鉴定。
参考文献
1. Ridgeway NH, et al. Uncovering Enzyme-Specific Post-Translational Modifications: An Overview of Current Methods. Proteomes, 2025.
2. Luo J, et al. Capturing acyl–enzyme intermediates with genetically encoded 2,3-diaminopropionic acid for hydrolase substrate identification. Nature Protocols, 2024, 19: 2967–2999.
3. Roux KJ, et al. BioID as a Tool for Protein-Proximity Labeling in Living Cells. Methods Mol Biol, 2019, 2012: 299–313.
4. Iconomou M, Saunders DN. Enzyme–substrate relationships in the ubiquitin system: approaches for identifying substrates of ubiquitin ligases. Cell Mol Life Sci, 2017, 74: 3363–3375.
5. Bhuripanyo K, et al. Identifying the substrate proteins of U-box E3s E4B and CHIP by orthogonal ubiquitin transfer. Science Advances, 2018, 4(1): e1701393.
6. Ridgeway NH, et al. Machine learning-driven prediction of substrates for enzymes introducing or removing protein post-translational modifications. Communications Chemistry, 2025.
7. Vinogradov AA, et al. Accurate Models of Substrate Preferences of Post-Translational Modification Enzymes from a Combination of mRNA Display and Deep Learning. ACS Central Science, 2022.
8. Gary CR, et al. Kinase-catalyzed Biotinylation with Inactivated Lysates for Discovery of Substrates (K-BILDS). Current Protocols, 2023.
关键词： 目的蛋白是一个修饰酶，应该怎么找对应的底物？两条靶点挖掘路径让你明确信号网络
相关资讯
双喜临门！谱度众合连获2026年“武汉市人工智能企业”和“武汉市大数据企业”双项殊荣
2026-07-30
谱度众合亮相贵州大学溪山生物医药创新论坛：高通量质谱技术驱动药物靶点精准筛选
2026-07-30
科研不容试错，标准铸就信任！谱度众合PRM靶向检测省级团体标准正式获批！
2026-07-30
二十年质谱技术沉淀助力于您的蛋白质研究
谱度众合是一家由武大生科院博士师兄弟创办的科研服务企业，团队延续课题组方向持续深耕专业领域20年，一直专注于利用质谱技术服务于生物标志物发现、药物靶点筛选、分子机制解析等研究领域，致力于为生物医学科研工作者提供靠谱的高效率科研工具。
业务咨询