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植物IP-MS实验指南：动植物样本核心差异与全流程实操SOP

所属分类： 技术干货

发布时间： 2026-04-13

概要： 今天给大家带来一套经过优化、适用于拟南芥、水稻、玉米等主流植物的全流程标准实操SOP。




很多研究者做植物蛋白时查阅文献，都会发现一个普遍的痛点：当前主流数据库里的免疫共沉淀-质谱（IP-MS）SOP大多是基于HEK293、HeLa等哺乳动物细胞系开发的。植物系统有着高度复杂且动态的次生代谢产物网络，直接套用动物的IP-MS方案往往会出现背景噪音爆炸、互作蛋白丢失、实验彻底失败等问题。究其根本，是植物与动物在细胞结构、生化组成上存在着不可忽视的本质差异。

今天我们先厘清动植物IP-MS样本制备的核心区别，再给出一套经过优化、适用于拟南芥、水稻、玉米等主流植物的全流程标准实操SOP。

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一、动植物IP-MS样本制备的四大核心差异


植物系统独有的细胞壁、次生代谢产物、极端蛋白丰度差异和液泡蛋白酶系统，是导致动物方案失效的四大根源，具体差异与应对策略如下表：

【各差异点核心注意事项】



细胞壁屏障：

不仅需要液氮研磨至粉末状，对于质膜、细胞壁结合蛋白，常规裂解液无法有效提取，需额外采用离子强度梯度洗脱或质外体预分离技术。



多酚干扰：

多酚氧化后会共价交联蛋白，屏蔽抗体表位和胰蛋白酶切位点，PVPP必须临用前加入，且研磨破壁第一时间就要接触多酚。



RuBisCO干扰：

其巨量肽段会引发质谱“离子抑制效应”，完全掩盖低丰度的转录因子、受体激酶等调控蛋白，绿色组织样本必须进行RuBisCO耗竭。



蛋白酶降解：

植物液泡占细胞体积80%以上，破裂后会释放大量酸性物质和广谱蛋白酶，单一PMSF完全无效，必须使用多靶点的植物专用抑制剂组合。

二、植物IP-MS全流程标准实操SOP


本SOP覆盖从样本采集到质谱肽段制备的全流程，所有操作均在4℃或冰浴条件下进行，除非另有说明。

1. 植物IP通用裂解液配制（临用前现配）

2. 样本瞬时淬灭与物理破碎



样本量：

每个生物学重复起始鲜重不低于2-5g（低丰度蛋白需适当增加）



淬灭：

目标时间点用预冷剪刀快速取样，3秒内浸入液氮，避免机械损伤诱导的蛋白组变化



研磨：

液氮预冷研钵，将组织研磨成极细粉末，全程持续补充液氮，严禁任何局部融化

3. 靶蛋白提取与内源性干扰物耗竭

❶ 按1g组织加2-3mL预冷裂解液的比例重悬粉末，冰浴超声2次×15秒（间隔30秒，低功率），4℃摇床温和孵育30分钟

❷ 4℃ 14000-20000×g离心15-20分钟，小心吸取澄澈上清，弃细胞壁残渣、PVPP沉淀

❸ 绿色组织专属步骤：向上清中缓慢滴加1%硫酸鱼精蛋白母液至终浓度0.1%，边加边轻柔涡旋，冰浴30分钟后，12000×g离心10分钟，取上清（此时RuBisCO已沉淀）

❹ BCA法测定总蛋白浓度，用空白裂解液将所有样本的蛋白浓度和总体积严格调平，取少量作为Input对照

4. 免疫共沉淀（磁珠法，推荐纳米抗体磁珠）

❶ 取20-50μL GFP-Trap/ProteinA/G磁珠，用预冷裂解液洗涤3次，磁力架分离弃上清

❷ 加入调平后的蛋白裂解液，4℃低速旋转孵育2-4小时（严禁过夜），避免瞬时互作解离和蛋白酶降解

❸ 磁力架分离，保留少量上清作为Flow-through对照；用不含PVPP的预冷HEPES缓冲液快速洗涤磁珠4-5次（避免高盐/高去污剂洗涤，防止弱互作丢失）

5. 质谱前处理：蛋白洗脱与酶切

❶ 加2×Laemmli上样缓冲液重悬磁珠，95℃加热5-10分钟变性洗脱

❷ 关键质控：取10% 洗脱产物，与Input、Flow-through一起做Western Blot，验证靶蛋白富集效果，确认靶蛋白显著富集且无明显降解时，再进行后续质谱实验

❸ 剩余90%洗脱产物进行SDS-PAGE短跑胶，仅让蛋白进入分离胶1-2cm即停止，去除去污剂和盐离子

❹ 切下含蛋白的凝胶块，切成1mm3小块，依次进行脱色、DTT还原、碘代乙酰胺烷基化、质谱级胰蛋白酶37℃酶切过夜

❺ 用含0.1%甲酸的乙腈溶液抽提肽段，合并抽提液真空浓缩，C18固相萃取柱脱盐净化，-80℃保存待上机

6. 质谱数据采集与初步质控

❶ 采用纳升液相色谱-高分辨质谱（如Orbitrap系列），数据依赖型采集（DDA）结合无标定量（LFQ）

❷ 用SAINT算法进行初步背景过滤，保留FC≥4、FDR<1.0%且在3个以上生物学重复中稳定检出的候选蛋白

结语


以上就是植物IP-MS实验的核心操作流程，但要从海量质谱数据中筛选出真正有生物学意义的互作蛋白，严谨的对照组设计才是决定性因素。

下一篇我们将针对生长发育、逆境响应、抗病免疫、代谢调控等不同研究目的，详解植物IP-MS的对照组设计黄金法则，帮你避开90%的假阳性陷阱。

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参考文献


  • 1. Linares A, Härter NC, Rannou E, Bischof S. Identification of plant chromatin interaction networks using IP-MS and co-IP. In: Baroux C, Tatout C, eds. Methods for Plant Nucleus and Chromatin Studies: Methods and Protocols. Humana Press; 2025:129-144. Methods in Molecular Biology, vol 2873.

  • 2. Damool D, Kretschmer M, Devendrakumar KT, et al. A fungal effector targets the chloroplast to support biotrophy by balancing disease and plant health. bioRxiv. Preprint posted online March 26, 2026. 

  • 3. Wang WQ, Jensen ON, Møller IM, Hebelstrup KH, Rogowska-Wrzesinska A. Evaluation of sample preparation methods for mass spectrometry-based proteomic analysis of barley leaves. Plant Methods. 2018;14:72.

  • 4. van Andel E, Roosjen M, van der Zanden S, et al. Highly specific protein identification by immunoprecipitation-mass spectrometry using antifouling microbeads. ACS Appl Mater Interfaces. 2022;14(20):23102-23116.

  • 5. Dickey B, Singh Y, Maharjan S, Qiu Y, Chen S. Capturing protein-protein interactions in plants: recent advances, challenges, and opportunities. Front Mol Biosci. 2026;13:1777595.

  • 6. Bontinck M, Van Leene J, Gadeyne A, et al. Recent trends in plant protein complex analysis in a developmental context. Front Plant Sci. 2018;9:640.

  • 7. Liu X, Abad L, Chatterjee L, Cristea IM, Varjosalo M. Mapping protein-protein interactions by mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. 2026;45:69-106.

  • 8. Nouri M. Mass Spectrometry of Protein Post-Translational Modifications Protocol. protocols.io. Published January 15, 2026.

  • 9. APEXBIO Technology. Cell Lysis Buffer for WB and IP Protocol (Cat. No. K1123). Houston, TX: APEXBIO Technology. 

  • 10. Pollner A, Rajesh V. SOP25v2_TGD_Immunoprecipitation. protocols.io. Published April 6, 2024.

  • 11. Pollner A, Rajesh V. SOP25v2_TGD_Immunoprecipitation. protocols.io. Published April 6, 2024. Accessed April 9, 2026.

  • 12. APEXBIO Technology. Cell Lysis Buffer for WB and IP Protocol (Cat. No. K1123). Houston, TX: APEXBIO Technology. Accessed April 9, 2026.





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