今天和大家分享一项发表于国际顶级期刊Gut的最新研究，标题为“ISG15 deficiency in hepatic stellate cells promotes TGFβ2-induced liver fibrosis by counteracting CREB1 ISGylation”。该研究聚焦肝纤维化临床治疗难点，首次揭示了干扰素刺激基因15（ISG15）通过ISG化修饰调控肝星状细胞（HSCs）活化的关键机制：ISG15缺失可解除对CREB1的抑制，促进TGFβ2转录及SMAD2信号通路激活，最终加速肝纤维化进程，为肝纤维化的靶向治疗提供了新靶点和理论依据。

该研究由华中科技大学同济医学院附属同济医院陈孝平教授团队主导，谱度众合为研究提供了关键的IP-MS蛋白互作组学研究解决方案，成功鉴定出ISG15的直接互作蛋白CREB1，并揭示其通过ISG化修饰抑制TGFβ2/SMAD2信号通路，从而延缓肝纤维化进展的分子机制。研究还通过多种体内模型验证CREB1抑制剂666-15的抗纤维化效果，为肝硬化的靶向治疗提供了新的可行策略与分子靶点。

本研究采用“临床样本验证—基因修饰动物模型—细胞机制解析—治疗策略验证”的系统研究策略：

❶ 临床样本分析：收集两批人肝组织样本（肝硬化vs非肝硬化），通过qPCR、免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）染色，分析ISG15表达与肝纤维化程度的相关性。

❷ 体内模型构建：构建HSC特异性ISG15敲除小鼠，通过自然衰老模型、CCl4诱导、BDL手术及MASH饮食诱导四种肝纤维化模型，评估ISG15缺失对肝纤维化的影响。

❸ 体外功能验证：构建ISG15敲除、UBE2L6敲低（降低ISG化）、USP18敲低（增强ISG化）的LX-2细胞系及原代人HSCs，验证ISG15对HSCs活化、增殖及ECM产生的调控作用。

❹ 机制解析：通过蛋白质组学筛选ISG15缺失后的差异表达蛋白（如TGFβ2）；结合谱度众合提供的IP-MS蛋白互作组学研究解决方案，成功鉴定出ISG15与CREB1的相互作用；进一步联合ChIP-qPCR、荧光素酶报告基因检测等技术，阐明了ISG15-CREB1-TGFβ2/SMAD2调控轴的作用机制。

❺ 治疗潜力验证：在CCl4诱导的肝纤维化模型中，评估ISG15过表达或CREB1抑制剂666-15的抗纤维化效果。

HSC特异性ISG15缺失（ISG15cKO）小鼠在18月龄时出现自发性肝纤维化，表现为肝脏表面纹理不规则、肝组织羟脯氨酸含量升高，αSMA和Col1α1等纤维化标志物表达上调，同时伴随炎症基因（IL1B、CCL5等）表达升高。组织学分析显示，18月龄ISG15cKO小鼠存在大量弥漫性ECM沉积和HSCs活化，炎症浸润明显增强。

在CCl4、BDL及MASH饮食诱导的实验性肝纤维化模型中，ISG15cKO小鼠均表现出更严重的肝损伤和纤维化：血清ALT/AST水平升高，肝组织羟脯氨酸含量增加，胶原沉积和纤维化间隔形成更显著，αSMA表达及炎症浸润均强于野生型小鼠，证实ISG15缺失可显著促进肝纤维化进展。

蛋白质组学分析显示，ISG15KO的LX-2细胞中存在481个差异表达蛋白，其中TGFβ2是上调最显著的炎症相关蛋白之一。Western Blot和ELISA验证证实，ISG15KO或UBE2L6敲低的LX-2细胞中，TGFβ2蛋白表达及分泌水平显著升高，而USP18敲低可降低TGFβ2表达。

机制上，ISG15缺失可激活SMAD2磷酸化（TGFβ通路经典下游事件），而TGFβ2 siRNA转染可逆转ISG15缺失诱导的HSCs活化表型。体内实验中，抗TGFβ2抗体处理显著减轻了ISG15cKO小鼠的肝纤维化程度，降低血清ALT/AST水平和肝组织羟脯氨酸含量，证实TGFβ2是ISG15缺失介导肝纤维化的关键下游分子。值得注意的是，ISG15缺失仅影响TGFβ2表达，对TGFβ1和TGFβ3的分泌无显著影响，体现了调控的特异性。

（5）ISG15通过ISG化修饰CREB1抑制其转录活性

IP-MS分析鉴定到CREB1是ISG15的关键互作蛋白。Co-IP实验证实，ISG15与CREB1存在内源性相互作用，且该相互作用依赖ISG15的C端双甘氨酸基序（为ISG化修饰所必需）。表面等离子共振（SPR）实验进一步表明ISG15与CREB1直接结合。

分子对接与点突变实验显示，ISG15通过ISG化修饰CREB1的Lys-304和Lys-305位点，该修饰抑制CREB1的Ser-133位点磷酸化，减少其核转位。ChIP-qPCR结果显示，ISG15缺失可增强CREB1与TGFβ2启动子区域CRE-L序列的结合，从而促进TGFβ2转录；而CREB1的Lys-304/305突变可逆转ISG15的抑制作用。

（6）ISG15过表达或CREB1抑制剂666-15具有抗纤维化效果

在CCl4诱导的肝纤维化模型中，通过AAV载体靶向HSCs过表达ISG15，可显著减轻ISG15cKO小鼠的肝损伤和纤维化，降低血清ALT/AST水平、肝组织羟脯氨酸含量及纤维化标志物表达，同时抑制CREB1磷酸化与TGFβ2表达。

鉴于CREB1在肝硬化患者肝组织中高表达，且与活化HSCs共定位，研究进一步验证了CREB1抑制剂666-15的治疗效果。结果显示，666-15腹腔注射可显著降低ISG15cKO小鼠的血清ALT/AST水平和肝组织羟脯氨酸含量，减轻胶原沉积和炎症浸润，下调αSMA、Col1α1等纤维化标志物，证实CREB1抑制可有效逆转ISG15缺失介导的肝纤维化。

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研究结论

1. 机制研究

首次发现ISG15在肝纤维化中的保护作用，阐明其通过ISG化修饰调控CREB1活性的新机制，拓展了类泛素修饰在肝脏疾病中的功能认知。

2. 靶向特异性

明确ISG15仅调控TGFβ2亚型，而非TGFβ1或TGFβ3，为精准靶向治疗提供了分子基础，可避免泛TGFβ抑制剂的副作用。

3. 临床关联性强

通过临床样本证实ISG15与肝纤维化呈负相关，且CREB1在肝硬化患者中高表达，为通路的临床相关性提供了直接证据。

4. 治疗潜力明确

同时验证了ISG15过表达与CREB1抑制剂的抗纤维化效果，尤其666-15已在其他疾病模型中表现良好安全性，具备快速临床转化的潜力。

5. 技术支撑全面

整合基因编辑、多组学测序、IP-MS、ChIP-qPCR等多种技术，结合四种体内模型和体外细胞实验，确保结果的可靠性和严谨性。