物理分离法是膜蛋白提取的第一步，核心是基于膜蛋白与胞内蛋白的物理性质差异，实现细胞膜组分与其他细胞组分的初步分离。它操作简单、兼容性强，是后续精细纯化的基础，主要分为两大核心方法。

基于不同细胞组分的沉降系数差异，通过逐步提升离心转速，从低到高分步分离不同组分。先通过低速离心去除细胞碎片、细胞核等大质量组分，再通过高速离心富集细胞膜组分，最终得到膜蛋白粗提物。

操作门槛低、通量高，是膜蛋白提取的“入门级操作”。但分离精度有限，仅能实现粗分，无法区分不同膜结构来源的蛋白，通常作为实验的前处理步骤。

基于不同组分的浮力密度差异，在蔗糖、碘克沙醇等介质形成的连续/不连续密度梯度体系中进行离心，让不同密度的细胞膜组分、细胞器组分停留在梯度介质的对应位置，实现比差速离心更精细的分离。

分离精度远高于差速离心，可精准分离不同来源的膜组分。比如血浆中细胞外囊泡（EV）的膜蛋白分离，就常采用碘克沙醇密度梯度离心，实现EV组分与非EV组分的精准拆分，是膜蛋白细分的核心物理方法。

物理分离仅能实现膜组分的富集，而膜蛋白的跨膜区富含疏水氨基酸，在水溶液中极易聚集、变性。想要获得可用于后续实验的可溶性膜蛋白，就必须依靠溶解分离法，这也是膜蛋白提取最核心的环节。目前主流的溶解方案分为去垢剂法和纳米盘/肽盘法两大类。

去垢剂是兼具亲水头部和疏水尾部的两亲性分子，也是膜蛋白提取中最常用的试剂。它既能通过疏水相互作用破坏细胞膜的磷脂双分子层，释放膜蛋白，又能包裹住膜蛋白的疏水跨膜区，避免其在水溶液中聚集变性，大幅提升膜蛋白的水溶性。

根据亲水头部的特性，去垢剂可分为三大类，不同类型适配完全不同的实验场景：

● 核心特点：亲水头部带有电荷，溶解能力极强，但会严重破坏蛋白的高级结构，导致蛋白高度变性。

● 代表试剂：SDS、SDC

● 适用场景：仅适合无需保留蛋白活性的实验，比如膜蛋白的定性鉴定、SDS-PAGE电泳、WB检测等。

● 核心特点：亲水头部不带电荷，对蛋白的变性作用极弱，在溶解膜蛋白的同时，能最大程度保留蛋白的天然构象和生物学活性，是功能研究的首选。

● 代表试剂：DDM、NP-40、TritonX-100、Tween-20

● 适用场景：膜蛋白互作实验、蛋白纯化与功能验证、Co-IP等需要保留蛋白活性的实验。其中DDM因与膜蛋白疏水特性高度匹配、临界胶束浓度（CMC）低、与质谱兼容性好，成为整合膜蛋白、多跨膜蛋白提取纯化的金标准试剂，在土拉弗朗西斯菌膜蛋白CapA的纯化实验中，DDM就展现出了远超其他去垢剂的溶解与稳定效果。

● 核心特点：头部同时带有正负电荷，兼顾了离子型去垢剂的强溶解能力和非离子型去垢剂的低变性特性，是高疏水性膜蛋白提取的“利器”。

● 代表试剂：CHAPS、CHAPSO

● 适用场景：高疏水性多跨膜蛋白的溶解，常与非离子型去垢剂DDM复配使用，进一步提升难溶膜蛋白的溶解度。

去垢剂虽能实现膜蛋白的溶解，但无法完全模拟细胞膜的天然磷脂环境，部分磷脂依赖性膜蛋白在去垢剂体系中仍会失去活性。而纳米盘/肽盘技术的核心优势，就是不破坏膜结构，在体外重构出接近天然细胞膜的微环境，完美维持膜蛋白的空间构象和生物学活性。

● 核心原理：通过MSP支架蛋白/膜活性聚合物（MAP），搭配天然细胞磷脂，在膜蛋白周围形成闭合的类膜脂双层纳米盘结构，将膜蛋白包裹其中，完全模拟其在细胞膜中的天然环境。

● 核心优势：对膜蛋白的天然结构保护性极强，尤其适合磷脂依赖性膜蛋白、多跨膜蛋白的提取与功能研究。最新研究显示，通过筛选优化的MAP聚合物制备纳米盘，膜蛋白溶解效率超50%，可提取的膜蛋白数量远多于传统去垢剂法，还能实现纳米级空间分辨的膜蛋白原位提取。

● 核心原理：利用20-30个氨基酸组成的疏水短肽，通过疏水相互作用包裹膜蛋白的疏水区域，形成稳定的肽盘结构。

● 核心优势：无需依赖磷脂，操作更简便，短肽支架无蛋白酶切位点、无热聚集性，尤其适配高通量质谱筛选，更适合单跨膜小蛋白的提取与鉴定。

经过粗分和溶解后，样本中仍含有大量胞内蛋白杂质，对于细胞膜表面蛋白、低丰度膜蛋白的研究，还需要通过富集分离法实现靶向富集，大幅提升目标膜蛋白的纯度，降低实验背景。

目前应用最广的富集方案是生物素标记富集法，也是活细胞膜表面蛋白标记的金标准。

选用膜不可穿透性的生物素试剂（如Sulfo-NHS-生物素），仅对活细胞表面膜蛋白的伯胺基团（主要是赖氨酸残基）进行特异性标记，再通过链霉亲和素磁珠/珠子，对标记了生物素的膜表面蛋白进行亲和富集，最终获得高纯度的细胞膜表面蛋白。

靶向性极强，富集后的样本中膜表面蛋白占比极高，能有效避免胞内蛋白的背景干扰，是膜表面蛋白组学、细胞外囊泡膜蛋白鉴定的核心方法。

普通NHS-生物素存在膜渗透性，孵育时间过长会进入胞内导致背景偏高，因此活细胞表面蛋白标记优先选用无膜渗透性的Sulfo-NHS-生物素，反应pH控制在8.0-8.5之间，可实现最优标记效果。

不同的实验目标，对应完全不同的提取方案，这里给大家总结了适配不同场景的选择逻辑：

膜蛋白的提取，从来没有“最好的方法”，只有最适配实验目标的方法。那么在掌握了高效的提取技术后，如何进一步深入探索膜蛋白在复杂细胞环境中的动态互作网络？传统的免疫共沉淀（Co-IP）等方法在面对膜蛋白时，常因疏水跨膜结构导致的溶解两难、瞬时动态互作易解离等痛点而面临巨大挑战。

邻近标记（PL）技术凭借“先标记，后裂解”的活细胞检测策略，为这一困境带来了技术革新。它能够在活细胞内原位标记邻近蛋白，后续可采用严苛变性条件彻底溶解膜蛋白而不丢失互作信息，既解决了溶解性难题，又显著降低了非特异性背景噪音。

如果您想了解如何根据膜蛋白的动态特性、空间定位（如脂筏、ER腔或胞外域）精准匹配BioID、TurboID、APEX2或PUP-IT等主流工具，欢迎阅读丸子整理的：《BioID、TurboID、APEX与PUP-IT四大邻近标记在「膜蛋白互作」应用中的深度对比》。

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✔ 弱/动态/瞬时互作：基于邻近标记的特殊原理，可以动态捕获更多弱相互作用和瞬时相互作用的蛋白；

✔ 高亲和性：链霉亲和素的亲和效价强，且无需严格保证非变性条件，可以捕获更多膜蛋白的互作；

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