图2 从抗增殖表型筛选中发现CK1α MGD

由于LC-02-105活性适中，研究者通过改变与添加基团合成了一系列类似物用于增加效力。为探究活性，研究团队在MOLM13细胞中添加100nM或20nM化合物，通过蛋白质印迹验证化合物的降解活性。结果显示其中LC-04-087是最有效的CK1α MGD，命名为dCK1α-1。

图3 MOLM13细胞中CK1α降解的免疫印迹分析

为了进一步阐明观察到的结构-活性关系并获得三元复合物形成的结构见解，研究团队使用Maestro 13.5进行分子对接分析，模型显示吡唑并嘧啶基团与H353之间存在潜在的氢键相互作用。研究团队还进行了NanoBiT测定，以确认dCK1α-1诱导CRBN和CK α之间形成三元复合物的能力。结果表明，dCK1α-1在4μM浓度下可达到高达1500%的募集。

随后研究团队在野生型和CRBN缺失的MOLM13细胞中探究了dCK1α-1的CRBN依赖性，结果显示dCK1α-1在野生型MOLM13细胞中诱导显著降解，而不影响CRBN缺失的MOLM13细胞，并且通过多种药物证实了降解是由CUL4^CRBN泛素途径介导的。

为评估CK1α降解的动力学，研究团队在MOLM13细胞中用100nM的dCK1α-1进行了时间过程研究，结果表明，降解最早发生在2小时，并持续至少24小时，与此同时，MOLT4细胞的HiBiT数据显示dCK1α-1完全降解了MOLM13细胞中的CK1α。

图4 dCK1α-1诱导MOLM13细胞中强效、快速、选择性和CRBN依赖性CK1α降解

图5 dCK1α-1诱导MOLM13细胞周期阻滞和凋亡

为了进一步阐明dCK1α-1的抗增殖作用，研究团队探究了该化合物诱导的转录组范围的扰动。用200nM dCK1α-1或BAY-204（一种强效ATP竞争性CK1α抑制剂）处理的MOLM13细胞进行RNA测序。火山图显示，在dCK1α-1处理后，有2213个基因差异表达（倍数变化≥2，调整后的p值≤0.05），其中多数与BAY-204处理组重叠。KEGG通路分析表明，这些差异表达基因与细胞周期调控、p53信号传导、DNA修复等过程相关。GSEA分析进一步显示，在dCK1α-1处理的细胞中，DEG在细胞周期、p53信号传导、凋亡途径和MAPK信号传导中显著富集。研究团队还评估了dCK1α-1在7种AML细胞系（THP-1、HL-60、MV4−11、U937、Kasumi-1、HEL、MOLM13）中的抗增殖作用，合并了来自SJ3149的数据集和来自TMX-4116的PRISM数据。结果表明，dCK1α-1更有效地抑制TP53野生型AML细胞的增殖。

尽管dCK1α-1具有良好的代谢稳定性（半衰期630min，清除率1.98mL/min/kg），但其溶解度有限。为了提高溶解度和便于研究CK1α在体内的降解情况，研究团队基于dCK1α-1的对接模型，在溶剂暴露区引入吗啉基团，得到化合物dCK1α-2。发现dCK1α-2能够诱导HEK293 T细胞中CRBN和CK1α之间的三元复合物形成。TMT蛋白质组学分析显示，dCK1α-2在MOLM13细胞中表现出高度选择性的CK1α降解能力。

图7 一种有效的、选择性的且体内相容的CK1α MGD的开发

（6）dCK1α-2对小鼠异种移植模型中MOLM13生长的影响

研究团队进一步探究了dCK1α-2在小鼠异种移植模型中的治疗效果。通过在携带MOLM13细胞的小鼠异种移植模型中连续治疗14天，以进一步评价dCK1α-2经口灌胃的体内抗肿瘤疗效，发现dCK1α-2给药耐受性良好，对体重的影响极小。多种结果表明，dCK1α-2在体内有效抑制MOLM13异种移植肿瘤生长，在所有治疗组中观察到良好的耐受性。dCK1α-2成为首个口服生物可利用的CK1α选择性分子胶降解剂，为p53相关靶向治疗提供了新的策略。

图8 dCK1α-2对小鼠异种移植模型中MOLM13生长的影响