对于靶点研究而言，利用CRISPR进行基因敲除（KO）或激活（CRISPRa）是日常操作。我们以经典的lentiCRISPRv2（单载体双系统：同时表达Cas9和sgRNA）为例，详解构建流程。

不要盲目选择sgRNA，设计的质量直接决定剪切效率，其核心目的是确保sgRNA能高效、特异性识别靶基因，同时适配载体酶切位点，为后续插入载体做准备。

❶ On-target Score：优先选择分数高的序列（通常>0.6）。

❷ Off-target Score：检查是否有位于外显子区域的潜在脱靶位点。

❸ G的偏好：U6启动子转录起始位点偏好鸟嘌呤（G）。如果设计的20bp sgRNA首位不是G，务必在 5' 端额外加一个 G（即变成 21bp: 5'-G-N20-3'），这能显著提高转录效率。

❶ Forward Oligo: 5' - CACC + G + 20bp Target - 3'

❷ Reverse Oligo: 5' - AAAC + 20bp Target (Reverse Complement) + C - 3' (注意：如果 Fwd 加了 G，Rev 末端需补 C 配对)。

通过酶切打开载体骨架、去除冗余片段，同时防止载体自连，为sgRNA片段的插入创造精准位点。

37°C孵育30-60分钟。

跑0.8%琼脂糖凝胶。

【切记】BsmBI切下的是一个约2kb的Filler片段，你需要回收的是大的载体骨架条带（约13kb），必须切胶回收以彻底去除stuffer，否则会有极高的背景假阳性。

先通过退火形成双链sgRNA，再通过连接反应将其与载体骨架拼接，形成完整的重组质粒。如果载体已经切好并回收，可以直接进行连接；如果是未切载体，也可以进行一步法反应。

将Fwd和Rev Oligo各稀释至100μM，让单链Oligo形成双链结构，使其末端粘性与载体匹配：

【程序】PCR仪95°C 5min，然后以0.1°C/sec 的速度降温至25°C。

将双链 sgRNA 片段与酶切后的载体共价连接，构建重组质粒。

【程序】室温（22-25°C）放置1小时，或16°C过夜。

让重组质粒进入大肠杆菌宿主，通过细菌增殖实现质粒的大量复制，获得足够量的完整质粒用于后续实验。

慢病毒载体含有长末端重复序列（LTR），在大肠杆菌中极不稳定，容易发生同源重组导致质粒截短。

必须使用Stbl3、NEB Stable或SURE等重组缺陷型菌株。严禁使用DH5α！

转化后的平板和液体摇菌，建议在30°C或32°C下培养，而不是标准的37°C。低温能显著降低重组发生率。

精准扩增目的片段的同时，最大程度避免碱基突变，保证片段序列完整性，为后续克隆提供高质量模板。

永远不要用Taq酶扩增克隆片段！Taq 酶错配率为1/2000，且末端会加腺嘌呤（A）。可使用高保真酶，其出错率比Taq低50-100倍，且产生平末端。

不同聚合酶Buffer的盐离子浓度不同，Tm值也会改变。务必使用该品牌提供的在线Tm Calculator计算退火温度。NEB Q5酶通常推荐退火温度为Tm + 3°C。

特异性切割载体或目的片段，获得预设的末端结构，为后续连接反应创造条件，同时避免非特异性切割导致的片段紊乱。当你发现电泳图上一片弥散或出现了非预期的条带，很可能是发生了星号活性。

限制性内切酶在非优化条件下（如甘油浓度>5%、酶过量、反应时间过长、低盐或有机溶剂存在）会丧失特异性，乱切DNA。

❶ 酶的体积永远不要超过反应总体积的10%（通常酶液含50%甘油）。

❷ 严格遵守推荐的孵育时间，不要随意“过夜”。

❸ 使用高保真版本的内切酶，它们经过工程改造，极大降低了星号活性。

让载体与插入片段按最佳比例形成稳定的磷酸二酯键，减少空载体或多片段插入的无效连接，连接反应失败的常见原因是载体与插入片段比例失调。

【建议】将Buffer分装成小管（10-20μL），每次使用一管，避免反复冻融。闻到Buffer有强烈硫醇味（DTT）是正常的，但如果出现白色沉淀，需温热溶解。

快速筛选出含有重组质粒的阳性菌落，排除空载体或污染导致的假阳性，提高后续实验效率。当你挑了24个克隆，PCR全是阳性，但提质粒测序却全是空载体？可能遇到了“假阳性”。

转化板上残留了未连接的插入片段 DNA，或者你挑菌时沾到了平板表面的 DNA。PCR 极其灵敏，把这些背景扩增出来了。

❶ 引物策略：不要用插入片段本身的引物！一定要用载体骨架上的通用引物（如CMV-F, BGH-R）进行扩增。这样，空载体扩增出小条带，阳性克隆扩增出大条带，一目了然。

❷ 挑菌技巧：挑取菌落后，先在新的LB板上划线备份，再将枪头放入PCR管；或者将菌落稀释在水中，取1μL水样做模板，避免带入过多杂质。

三、质量控制 —— 从测序到去内毒素

拿到阳性克隆只是开始，必须经过严格质控才能用于后续实验，确保质粒序列正确、无杂质污染，满足后续细胞转染或动物实验的要求。

Sanger测序：金标准

验证重组质粒的序列准确性，确保目的基因（sgRNA）无突变、读码框正确，避免因序列错误导致实验失败。

不要为了省钱只测两端。对于融合蛋白，必须进行通读测序，确保全长序列无突变，且读码框完全对齐，没有移码。对于CRISPR质粒，必须确认sgRNA的20bp序列没有丢失碱基（常见错误）。

质粒提取

获得高纯度、低内毒素的质粒，避免杂质或内毒素影响后续细胞转染效率和实验结果。

内毒素（Endotoxin/LPS）：

大肠杆菌细胞壁成分。即使微量的内毒素也会显著降低原代细胞和干细胞的转染效率，并激活细胞的免疫反应，导致实验结果偏差。

必须步骤：

对于细胞转染（尤其是难转染细胞）和动物实验，必须使用去内毒素Maxiprep试剂盒。普通Miniprep质粒仅限用于酶切鉴定和测序。

标准：

转染级质粒的内毒素含量应<0.1EU/μg。

常见问题排查表

结语

质粒构建绝非“流水线式”的简单操作，而是“设计 - 策略 - 实战 - 质控”的完整逻辑闭环 —— 前期设计决定质粒的“先天潜力”，克隆策略选择影响构建效率，实操细节规避实验陷阱，质量控制保障最终可靠性。

从sgRNA的精准设计到内毒素的严格去除，每一个环节的细心把控，都将在后续实验中转化为清晰的结果与可靠的数据。

希望丸子的这份笔记能帮你避开隐蔽陷阱，让每一次克隆实验都能“一次成功”，为靶点筛选、基因编辑等研究筑牢根基。科研之路，细节为王，愿你在生物医学的探索中稳步前行，收获更多突破性成果~

往期回顾：

《蛋白互作干货 | 如何构建合格的重组表达质粒（初学者篇）》

联系丸子，了解更多~

推荐

谱度众合：研究动态、瞬时、弱相互作用的最佳工具—PL-MS蛋白邻近表达筛选解决方案

基于邻近标记技术联合质谱推出PL-MS蛋白邻近表达筛选解决方案，为客户提供从细胞构建培养、亲和富集实验到质谱高通量筛选的一站式服务（阶段可选）：①目标序列获取和质粒克隆构建、②基因编辑和细胞系构建、③细胞培养和临近标记、④生物素标记蛋白的亲和纯化富集、⑤蛋白提取和酶解、⑥质谱检测和⑦数据分析和互作网络构建。

✔ 弱/动态/瞬时互作：基于邻近标记的特殊原理，可以动态捕获更多弱相互作用和瞬时相互作用的蛋白；

✔ 高亲和性：链霉亲和素的亲和效价强，且无需严格保证非变性条件，可以捕获更多膜蛋白的互作；

✔ 避免阴性结果：基于质谱定量数据进行无偏见的高通量筛选，可以获得大量蛋白相互作用信息，避免阴性结果；

✔ 精准筛选：基于定量差异、蛋白功能注释、互作网络核心节点等多维度分析，提供候选邻近表达蛋白的清单；

✔ 原位精准表达：在目的基因N/C端原位插入标记酶，可获得更接近生理状态下的蛋白互作网络。

参考文献

• 1. Ashwini M, Murugan SB, Balamurugan S, et al. Mol Biol (Mosk). 2016;50(1):3-9. doi:10.7868/S0026898416010134

• 2. Heckl D, Kowalczyk MS, Yudovich D, et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 2014;32(9):941-946. doi:10.1038/nbt.2951

• 3. Joung J, Konermann S, Gootenberg JS, et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 2017;12(4):828-863. doi:10.1038/nprot.2017.016

• 4. Cong L, Zhang F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods Mol Biol. 2015;1239:197-217. doi:10.1007/978-1-4939-1862-1_10

• 5. Lessard JC. Molecular cloning. Methods Enzymol. 2013;529:85-98. doi:10.1016/B978-0-12-418687-3.00007-0

点击下方“阅读全文” 获取资料