从「未知」到「已知」靶点验证：DARTS技术实操指南与常见问题诊断
所属分类： 技术干货
发布时间： 2026-01-22
概要： 药物靶点的鉴定与验证是药物研发的核心环节，直接决定了药物研发的成功率。
药物靶点的鉴定与验证是药物研发的核心环节，直接决定了药物研发的成功率。
DARTS（Drug Affinity Responsive Target Stability）技术作为一种基于 “药物 - 靶点结合增强蛋白稳定性” 的靶点鉴定方法，凭借无需药物共价修饰、操作简便、适用范围广等优势，被广泛应用于已知靶点验证和未知靶点筛选。
本指南将详细拆解 DARTS 技术的实验准备、操作步骤、结果分析及关键注意事项，为科研人员提供标准化的实操参考。
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一、实验准备
关键试剂
裂解液:M-PER (Thermo) 或 自制 TNS Buffer (50mM Tris-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 0.5% NP-40)；
蛋白酶:Pronase (Roche #10165921001 或 Sigma #P6911)；
【注】Pronase是多种酶的混合物，切割位点广谱，是DARTS的首选。
小分子药物: 溶解于 DMSO 或 PBS；
蛋白浓度测定试剂盒: BCA Assay Kit。
【重要提醒】裂解液中严禁添加任何蛋白酶抑制剂！可以添加磷酸酶抑制剂。
仪器
冷冻高速离心机
金属浴/水浴锅 (控温 25℃ 或 Room Temp)
SDS-PAGE 电泳及转膜系统
二、操作步骤
Step 1: 样品裂解
❶ 收集细胞（约 107个）或研磨组织；
❷ 加入冷裂解液（含磷酸酶抑制剂，无蛋白酶抑制剂），冰上裂解 10-15 min；
❸ 14,000 rpm，4℃ 离心 10-15 min；
❹ 收集上清液，立即进行 BCA 蛋白定量；
❺ 将所有样品的蛋白浓度调整一致（建议 2-5 mg/mL）。
Step 2: 药物孵育
❶ 将蛋白溶液分装；
❷ 实验组：加入目标药物（常用浓度：10× 或 100× IC50，若未知建议 10-100 μM）；
❸ 对照组：加入等体积的溶剂（如 DMSO）；
❹ 孵育：室温孵育 30-60 min，伴随轻微晃动（避免剧烈涡旋破坏蛋白）。
Step 3: 限制性酶解 —— 关键步骤
此步骤需预实验摸索最佳酶浓度，建议设置梯度。
1.配制 Pronase 母液：
用去离子水配制成 10 mg/mL，现配现用；
2. 酶解反应：
在药物组和对照组中分别加入 Pronase；
推荐比例酶（蛋白, w/w）：建议设置 1:100, 1:500, 1:1000, 1:2000 四个梯度。
【注】初次实验必须摸索比例，寻找“对照组条带部分降解，药物组条带明显保留”的窗口。
3. 反应条件：
室温反应 15-30 min（时间需精确控制）。
Step 4: 终止反应
❶ 直接向反应管中加入 5× SDS-PAGE Loading Buffer；
❷ 立即置于 95-100℃ 金属浴煮沸 5-10 min。
【此时高温会使酶失活，无需额外加抑制剂；若无法立即煮沸，可先加大量蛋白酶抑制剂终止，再煮沸。】
Step 5: 检测与分析
1. 路径 A：已知靶点验证
实验：Western Blot
结果判读：对比同等酶浓度下，药物组的条带密度 > 对照组 (即 Drug+ 泳道有条带，DMSO 泳道条带消失或变淡)，则证明药物结合保护了靶点。
场景 A：Western Blot 结果分析
2. 路径 B：未知靶点筛选
实验：进行 SDS-PAGE，跑胶至底部；考马斯亮蓝染色或银染；
差异分析：寻找在药物组中存在（被保护）但在对照组中消失的条带；
鉴定：切下差异条带，进行胶内酶解和 LC-MS/MS 质谱鉴定。
场景 B：质谱 (LC-MS/MS) 筛选结果分析
三、常见问题排查
1. 酶解过度或不足
如果跑胶后，所有泳道都是碎片段或空白 —— 酶太多/时间太长，降低酶比例。
如果对照组条带依然很亮，没有任何降解 —— 酶太少/时间太短，增加酶比例或延长反应时间。
2. 膜蛋白处理:
膜蛋白在去垢剂胶束中可能对 Pronase 不敏感。若 DARTS 效果不佳，建议尝试 TPP (Thermal Proteome Profiling) 或 LiP-MS 技术。
3. 非特异性保护:
高浓度药物可能会引起非特异性的蛋白聚集，导致假阳性。建议增加阴性对照化合物（结构类似但无活性的分子）进行验证。
4. DNA干扰:
如果是 DNA 结合蛋白，DNA 的存在会保护蛋白。裂解时建议加入 DNAse 去除核酸干扰。
5. 数据呈现:
文章发表时，务必展示酶浓度梯度的胶图，证明是在“限制性酶解”条件下观察到的保护作用，而非酶没起作用。
四、进阶分析
1. "GAPDH 陷阱"
做 WB 时，千万不要习惯性地只把 GAPDH/Actin 当作 Loading Control。
原因：
在 DARTS 实验中，Loading Control 是为了证明起始蛋白量一致，而不是证明酶解后一致。
操作：
应该在未加酶的样品中跑 GAPDH 来证明上样量一致；在加酶的样品中，GAPDH 理论上应该也被降解（除非它是靶点）。如果加酶组 GAPDH 完好无损，说明酶没起作用。
2. 别构效应的判断：
如果你发现全长蛋白条带减少了，但下面出现了一个清晰的小分子量截断条带，且这个截断条带在药物组中被增强/保护了。
这通常意味着药物结合引起了蛋白构象变化，或者药物结合在特定的结构域，这是一个非常有价值的结构生物学线索。
3. 统计学意义：
发表文章时，Reviewer 通常要求至少 3 次独立重复实验的 Western Blot 图片，并配上灰度定量的柱状图，标注 P 值。单次胶图很难被接受。
五、DARTS技术的升级方案 —— LiP-MS技术
尽管 DARTS 技术在靶点验证中表现优异，但在未知靶点筛选场景中仍存在局限性：
依赖 Western Blot 或质谱对差异条带的鉴定；
对低丰度蛋白、膜蛋白的覆盖不足；
筛选过程中易出现假阳性 / 假阴性。
而 LiP-MS技术作为 DARTS 的升级版，完美解决了这些痛点，其核心优势在于不依赖抗体，实现了更高效、更全面的药物靶点筛选。
原理一致但技术升级
LiP-MS 沿用了 “药物结合靶点→蛋白构象改变→酶解抗性差异” 的核心原理，但在技术流程上进行了关键优化：首先，采用更精准的限制性酶解策略，结合定量蛋白质组学技术，无需通过凝胶分离差异条带，直接对酶解后的肽段进行质谱分析；其次，通过比较药物组与对照组中各蛋白的肽段丰度差异，可快速锁定被药物保护的靶蛋白，无需依赖特异性抗体进行验证。
Buff加成
相较于 DARTS，LiP-MS 的优势体现在三方面：
覆盖范围更广，能有效检测膜蛋白、低丰度蛋白等 DARTS 难以捕捉的靶点；
筛选效率更高，避免了凝胶染色、条带切割等繁琐步骤，实现高通量筛选；
特异性更强，通过肽段水平的定量分析，减少了高丰度蛋白带来的假阳性干扰。
因此，当研究中缺乏靶点抗体、需快速筛选未知靶点，或针对膜蛋白等特殊靶点时，LiP-MS 是比 DARTS 更优的选择。
六、结语
DARTS 技术作为经典的靶点鉴定工具，其核心在于通过 “限制性酶解条件的精准优化” 和 “严谨的对照设计”，实现已知靶点的高效验证和未知靶点的初步筛选，操作简便、成本可控，是药物研发初期的重要手段。而 LiP-MS 技术作为其升级版，以 “不依赖抗体” 的核心优势，突破了 DARTS 在筛选范围和效率上的局限，为未知靶点筛选提供了更强大的技术支撑。
科研人员在实际应用中，可根据实验目的灵活选择：已知靶点验证优先采用 DARTS 技术，兼顾性价比与可靠性；未知靶点筛选、无抗体可用或针对特殊蛋白（如膜蛋白、低丰度蛋白）时，建议采用 LiP-MS 技术。无论选择哪种技术，都需重视预实验摸索、标准化操作和生物学重复，同时结合竞争性实验、阴性对照等手段排除干扰，确保实验结果的真实性和可靠性。希望这篇指南能为大家提供清晰的实操参考，助力药物靶点鉴定工作的顺利开展~
推荐
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✔ 药物靶点筛选：在体外生理条件下，寻找小分子药物可能的作用靶点。
✔ 药物-蛋白结合域分析：于体外生理条件中，探究纯化重组蛋白和目标药物的作用区域以及结合位点。
✔ 药物机制研究：在体内给药的条件下，钻研小分子药物潜在的作用靶点及其发挥作用的机制。
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参考文献
[1] Lomenick B, Hao R, Jonai N, et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(51):21984-21989.
[2] Pai MY, Lomenick B, Hwang H, et al. Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) for Small-Molecule Target Identification. Methods Mol Biol. 2015;1263:287-298.
[3] Schenone M, Dančík V, Wagner BK, Clemons PA. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 2013;9(4):232-240.
关键词： 从「未知」到「已知」靶点验证：DARTS技术实操指南与常见问题诊断
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