很多刚入门的朋友会被 “芯片” 误导，觉得二者是同类技术，其实它们一个负责 “初筛找候选”，一个负责 “验证定强弱”，完全对应靶点筛选的两个核心阶段。

做早期项目时，手里握着活性小分子，却完全不知道它跟哪个蛋白结合 —— 这时候蛋白芯片绝对是首选。

当蛋白芯片筛出 3-5 个候选靶点后，就该 SPR 登场了 —— 它的核心作用是“量化结合强度”，给出能直接用于论文或项目申报的精准数据。

● 最大的亮点是 “免标记”，能直接用原药实验，完全保留药物的天然活性，这也是它数据精准的关键。而且样本需求量特别小（微升级），能精准判断药物与靶点的结合特异性，是验证靶点的 “金标准”。

● 缺点也很明显：通量低，一次只能测几个到几十个样品；对蛋白纯度和活性要求极高 —— 如果蛋白纯化不到位，实验根本做不出可靠结果，这也是它成本偏高的原因。

候选靶点的动力学验证。比如要确认“药物是否真的结合这个靶点”“结合强度够不够”，或者比较不同先导化合物的亲和力，SPR 都是不可替代的选择。

做项目到深水区就会发现，蛋白芯片和SPR 再好用，也绕不开两个灵魂拷问：

“加了生物素标签，我的药物活性还在吗？”

“芯片上的纯化蛋白，真的能代表细胞里的真实状态吗？”

确实，传统技术要么依赖标记，要么用体外纯化蛋白，结果往往跟细胞内的真实情况有偏差。而 TPP 和 LiP-MS 代表的无标记质谱技术，正是冲着这两个痛点来的，堪称复杂场景下的“破局者”。

如果想知道药物在细胞内到底跟哪个蛋白结合，TPP 是我们最常推荐的技术 —— 它能还原细胞内的微环境，结果的生理相关性特别强。

很有意思，药物与靶蛋白结合后，会让蛋白的热稳定性提高（简单说就是 “变硬了”，更耐高温）。实验时把细胞裂解液或完整活细胞跟原药孵育，然后梯度升温，没结合药物的蛋白会逐步变性沉淀，再用质谱检测上清中可溶性蛋白的丰度变化，画出热稳定性曲线 —— 如果某蛋白的曲线明显偏移，就说明它是药物的潜在靶点。

● 优势太突出了：无标记，直接用原药；支持活细胞实验，保留了蛋白复合物、辅因子，结果贴近真实生理状态；通量也高，能一次评估数百种蛋白。而且数据处理有成熟的 R 包，不用自己瞎琢磨。

● 但它也有局限：它只能告诉你 “结合了”，没法定位具体的结合位点，后续需要搭配其他技术验证。

细胞内靶点验证、脱靶效应评估：比如蛋白芯片筛出候选后，用 TPP 确认 “这个靶点在细胞内真的能跟药物结合”；或者评估药物的安全性，排查可能的脱靶蛋白。

如果 TPP 没检测到信号，但你确信药物和靶点有结合，或者想知道药物具体结合在蛋白的哪个区域 —— 那一定要试 LiP-MS，它的分辨率是四大技术里最高的。

利用蛋白酶的 “酶切效应”—— 药物结合蛋白后，会形成空间位阻或改变蛋白构象，让结合区域的肽段不被蛋白酶（比如 Proteinase K）切开。通过质谱检测药物处理前后的肽段丰度变化，不仅能锁定靶蛋白，还能根据受保护的肽段位置，推测出结合口袋（Binding Pocket）的位置。

● 最大的亮点是 “肽段级分辨率”，能解决 TPP 的短板 —— 不仅找靶点，还能给药物设计提供结构信息。而且它能检测到变构效应，对于那些结合后不改变热稳定性，但会影响蛋白构象的相互作用，LiP-MS 是唯一的选择。

● 缺点是实验条件太敏感：酶切时间、比例稍微没控制好，结果就会偏差；数据处理也比较复杂，需要专业的软件和统计学方法，新手入门得花点时间。

结合位点定位、变构调节剂研究。比如要明确药物结合在蛋白的哪个结构域，或者 TPP 检测阴性但确信有结合的场景，LiP-MS 能给出精准答案。

整理了一张项目中最常用的对比表，关键维度都列全了，大家可以直接对着自己的需求选：

结合我们踩过的坑、总结的经验，给大家分场景明确建议，直接照用就行：

手里有活性小分子，但对靶点一无所知 —— 首选蛋白芯片。利用它的高通量优势，快速圈定一批候选靶点；如果想初步看一下亲和力，也可以搭配高通量 SPR 做辅助筛选。

【注意】蛋白芯片的标记可能带来假阳 / 阴性，筛出的候选靶点，一定要用 TPP 做细胞内验证，确认结合的真实性。

已经锁定 3-5 个候选靶点，需要确认结合特异性和强度 —— 必选 SPR。它给出的 KD、Kon、Koff 参数是论文和项目申报的 “硬数据”，能直接支撑后续的药物优化。

想知道药物在细胞内的真实作用靶点，或者评估安全性（脱靶效应）—— 首选 TPP。它能在活细胞环境中捕捉结合事件，同时发现直接和间接靶点，是评估药物作用谱的关键工具。

需要明确药物结合的具体区域，或研究变构调节剂 —— 首选 LiP-MS。如果 TPP 检测阴性但确信有结合，用 LiP-MS 大概率能找到答案，还能为药物结构优化提供直接依据。

做靶点筛选这么多年，最大的感悟是：技术没有好坏，只有适配与否。

蛋白芯片胜在 “广”，能快速打开局面；SPR 胜在 “精”，能夯实验证数据；TPP 和 LiP-MS 胜在 “真”，能还原细胞内的真实相互作用。我们踩过的标记影响活性、体外结果无法复现的坑，就是希望大家能根据项目阶段精准选型，少点纠结，多点高效。

如果正在为探针设计、结果复现头疼，不妨试试 TPP 和 LiP-MS 的无标记方案 —— 让药物在 “原生态” 中展现真实靶点，可能会少很多意外惊喜。

• [1] Sun B, Xu J, Liu S, Li QX. Characterization of Small Molecule-Protein Interactions Using SPR Method. Methods Mol Biol. 2023;2690:149-159. doi:10.1007/978-1-0716-3327-4_15

  
  

• [2] Sauer P, Bantscheff M. Thermal Proteome Profiling for Drug Target Identification and Probing of Protein States. Methods Mol Biol. 2023;2718:73-98. doi:10.1007/978-1-0716-3457-8_5

  
  

• [3] Malinovska L, Cappelletti V, Kohler D, et al. Proteome-wide structural changes measured with limited proteolysis-mass spectrometry: an advanced protocol for high-throughput applications. Nat Protoc. 2023;18(3):659-682. doi:10.1038/s41596-022-00771-x

  
  

• [4] Pepelnjak M, de Souza N, Picotti P. Detecting Protein-Small Molecule Interactions Using Limited Proteolysis-Mass Spectrometry (LiP-MS). Trends Biochem Sci. 2020;45(10):919-920. doi:10.1016/j.tibs.2020.05.006

点击下方“阅读全文” 获取资料