从案例到方法论深度解读：不做 Pull-down，天然产物的靶点还能怎么找？
所属分类： 技术干货
发布时间： 2025-12-19
概要： 蛋白质极少单打独斗，它们大多组装成蛋白质复合物来执行功能。既然是“抱团”干活，它们自然也会“抱团”沉淀。于是，热邻近共聚集（TPCA）技术应运而生：相互作用的蛋白在热变性时会共同聚集，往往表现出惊人相似的熔解曲线。
对于成分复杂、作用机制多元的天然产物而言，“找靶点” 向来是绕不开的核心难题：传统方法 Pull-down 技术试图通过药物分子探针捕获与之结合的靶蛋白，然而其局限性日益凸显：不仅需要复杂的化学修饰，还容易受非特异性结合的干扰，更无法反映药物在真实生理环境中对蛋白复合物的动态影响 —— ，这些短板往往导致靶点筛选 “竹篮打水”，机制研究陷入停滞。当 Pull-down 等传统方法遭遇瓶颈，无标记靶点发现技术的出现为天然产物研究带来了新的突破口。
提到无标记靶点发现技术，大家对 CETSA（细胞热位移分析）和 TPP（热蛋白质组分析）这对科研孪生技术的原理一定不陌生：“配体结合改变稳定性”—— 当药物与靶蛋白结合后，会改变蛋白的热稳定性，使其在高温下更难或更易变性沉淀，反映在熔解曲线上就是 “向右偏移”（Tm值升高）或向左偏移（Tm值降低）。但你是否注意到热变性过程中另一个更有趣的现象？
在细胞这个拥挤的“社交场所”里，蛋白质极少单打独斗，它们大多组装成蛋白质复合物来执行功能。既然是“抱团”干活，它们自然也会“抱团”沉淀。于是，热邻近共聚集（TPCA）技术应运而生：相互作用的蛋白在热变性时会共同聚集，往往表现出惊人相似的熔解曲线。
一、这对做天然产物研究的我们意味着什么？
如果能利用TPCA技术，直接监测药物处理后，哪些“形影不离”的复合物突然“分道扬镳”，或是哪些原本分散的蛋白突然“抱团”，是不是就能直接还原药物的“作案现场”，从系统层面说清机制？
今天，我们就通过拆解2025年发表在《International Journal of Biological Sciences》上的最新力作，结合2023年《Nature Communications》的方法学革新，带大家看看如何利用TPCA技术，解决天然产物“靶点难寻、机制难明”的核心痛点。
二、实战复盘：藜芦胺的抗癌“作案现场”全还原
主角登场
藜芦胺（Veratramine, VAM），一种从藜芦属植物根和根茎中提取的天然生物碱，已被证实对三阴性乳腺癌等多种癌细胞具有显著的抗增殖、抗迁移活性，但长期以来其作用靶点和核心机制一直是个谜。
研究团队没有选择传统的“钓鱼式”—— Pull-down，而是采用了一套“TPP+TPCA”的组合拳，从“靶点识别 - 复合物扰动 - 功能验证”一气呵成。
第一幕：TPP筛出“嫌疑靶点”
研究人员首先利用TPP（热蛋白质组分析）技术：简单来说，就是看药物结合后，哪个蛋白变得更“耐热”或更“不耐热”。
在筛选了5000多个蛋白后，一个名为ATP6V1C1的蛋白浮出水面：数据显示，VAM的存在显著降低了该蛋白的热稳定性（溶解度下降）。
【背景知识】ATP6V1C1并不是孤立存在的，它是V-ATPase（液泡型质子泵）复合物的一个关键亚基，其核心功能是维持溶酶体的酸性环境，为癌细胞的“保护性自噬”提供必要条件。
第二幕：TPCA还原“复合物扰动现场”
如果只停留在靶点识别，故事只能讲一半：“VAM结合了ATP6V1C1”。但TPCA技术的登场，让机制研究实现了从“单点”到“系统”的跨越，通过TPCA分析了整个V-ATPase复合物在细胞内的动态变化。
惊人的发现：
在没有药物时，V-ATPase复合物的各个亚基像手拉手一样，热变性曲线高度一致；
药物介入后：
整个复合物的曲线相关性崩了！呈现出典型的发散现象；
结论：
VAM不是简单地“摸”了一下ATP6V1C1，而是像楔子一样插进去，直接把整个V-ATPase复合物给“拆”了！
第三幕：功能验证揭示“最终结局”
既然复合物散伙了，功能自然瘫痪：
● V-ATPase无法维持溶酶体的酸性环境，导致溶酶体pH升高，进而阻断了癌细胞的自噬流；
● 癌细胞因无法进行“保护性自噬”，最终走向凋亡。
三、技术干货：如何把TPCA引进你的实验室？
看到这里，你可能心动了，但也担心：“这技术听起来很贵、很难吧？”不用担心！丸子结合方法学文献和技术社区经验，整理了一套适合实验室落地的“轻量化”方案：
1. 实验设计的革新：Slim-TPCA
温度点选择：
哺乳动物细胞优先用3个温度点（37°C、49°C、58°C）或4个温度点（37°C、46°C、55°C、61°C），植物或其他物种可先通过预实验确定平均熔解温度（Tm），再选择围绕Tm均匀分布的3-4个点；
样本处理：
建议用完整细胞（IntactCell）进行原位加热，再用温和裂解液（含0.2%-0.4%非离子型去污剂如DDM、NP-40，避免SDS）裂解，最大程度保留复合物原有状态；
标记策略：
用TMT10/16标记不同温度或不同处理组的样品，确保所有样品同时进行质谱分析，消除批次差异。
2. 样品制备避坑要点
非变性是核心：
裂解液不能含强变性剂，避免复合物在裂解阶段解离，导致假阴性；
加热条件统一：
每个温度点加热时间（推荐3分钟）、冷却速度需严格一致，用PCR仪或金属浴保证温度准确性；
蛋白定量：
离心后取上清，用BCA法精准定量可溶性蛋白，确保后续质谱分析的样品上样量一致。
3. 数据分析关键步骤
数据预处理：
将不同温度下的蛋白丰度归一化到37°C（参考温度），得到相对溶解度数据；
距离计算：
采用曼哈顿距离计算复合物亚基间的熔解曲线相似度；
统计学检验：
用Beta分布拟合或Bootstrap方法计算p值，筛选显著发散（p>0.95）或收敛（p<0.05）的复合物；
验证实验：
对候选复合物，可通过Co-IP验证亚基间相互作用的变化，或通过Westernblot检测复合物功能相关蛋白（如溶酶体酶、自噬标志物）的表达/活性。
总结：哪些场景适合用TPCA？
TPCA技术正在成为天然产物机制研究的“标配工具”，尤其适合以下情况：
❶ 有活性但靶点不明：天然产物活性显著，但Pull-down、酵母双杂交等方法无法找到靶点；
❷ 找到靶点但机制不清：已知药物结合某蛋白，但不知道该蛋白所在复合物及下游通路变化；
❸ 多靶点机制解析：天然产物可能存在多靶点，TPCA能同时捕捉多个复合物的扰动，揭示协同作用；
❹ 老药新用研究：想探索已知药物在新适应症中的作用机制，尤其是复合物层面的扰动。
结语
从藜芦胺的案例可以看出，TPCA正在打破天然产物“机制黑箱”——它不需要复杂的化学修饰，不需要特异性抗体，就能在细胞原位完整还原“药物结合靶点→复合物扰动→通路改变→功能结局”的全过程。随着Slim-TPCA等方法的优化，这项技术的门槛越来越低，相信会成为更多天然产物研究者的“得力助手”。如果你正为天然产物机制研究发愁，不妨试试TPCA技术，从“复合物动态”的视角，或许能打开一扇新的大门！
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参考文献
[1] Zhang S, Li FM, Wang J, et al. Integrated thermal proteome and thermal proximity co-aggregation profiling identifies ATP6V1C1 as a novel anti-cancer drug target. Int J Biol Sci. 2025;21(7):3197-3213. Published 2025 Apr 28. doi:10.7150/ijbs.106843
[2] Sun S, Zheng Z, Wang J, et al. Improved in situ characterization of protein complex dynamics at scale with thermal proximity co-aggregation. Nat Commun. 2023;14(1):7697. Published 2023 Nov 24. doi:10.1038/s41467-023-43526-2
[3] Teitz J, Sander J, Sarker H, Fernandez-Patron C. Potential of dissimilarity measure-based computation of protein thermal stability data for determining protein interactions. Brief Bioinform. 2023;24(3):bbad143. doi:10.1093/bib/bbad143
关键词： 从案例到方法论深度解读：不做 Pull-down，天然产物的靶点还能怎么找？
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