找不到激酶底物？找不到底物激酶？一篇教会你！
所属分类： 技术干货
发布时间： 2025-11-13
概要： 《Cancer Communications》《Nature》这两个顶刊居然就用 IP + 质谱这么简单的组合，把两大难题解决了。原来不用死磕老套路，找对工具就能少走好多弯路！
做激酶 - 底物互作研究的这些日子，我算是被传统方法 “磨” 得没了脾气 —— 想找已知激酶的直接底物，免疫沉淀、体外激酶实验轮番上阵，还要多轮验证排雷，可假阳性依旧扎堆，低丰度的磷酸化肽段根本抓不住，更别提精准定位修饰位点；反过来追已知底物的上游激酶，更是要堆砌多种技术，步骤繁琐到让人崩溃，却始终摸不清关键的调控链路。
实在扛不住了，我索性停了实验翻文献，结果还真被我找到了救命思路！《Cancer Communications》《Nature》这两个顶刊居然就用 IP + 质谱这么简单的组合，把两大难题全解决了。原来不用死磕老套路，找对工具就能少走好多弯路！我通过这两篇顶刊拆解出来了大家都能用的思路，一起看看吧~
一、已知激酶找底物：质谱技术精准 “锁定” 直接靶点
核心逻辑
从已知激酶出发，对比激酶激活 / 抑制状态下的磷酸化组差异，结合体外验证，筛选激酶直接磷酸化的底物（排除间接调控的 “伪底物”）。
质谱技术的核心作用
● 捕获低丰度磷酸化肽段，区分 “直接磷酸化” 与 “间接磷酸化”；
● 准确定位磷酸化位点，为激酶 - 底物互作提供直接证据；
● 高通量鉴定候选底物，避免传统 “逐一验证” 的低效问题。
IF：20.1 | IP-MS 联合修饰组学
揭示 AKT-pPCK1 轴介导的铁死亡抵抗
期刊：
Cancer Communications（2025）
研究背景：
蛋白激酶 B（AKT）高激活在肝内胆管癌（ICC）中普遍存在，与肿瘤细胞铁死亡抵抗密切相关；磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 1（PCK1）是糖异生关键酶，在 ICC 中参与代谢重编程，但 AKT 如何通过 PCK1 调控铁死亡抵抗的机制不明 —— 传统方法既无法明确 PCK1 的磷酸化修饰位点，也难以鉴定其下游直接底物及后续修饰调控链路。
所用质谱技术：
IP-MS（底物筛选）、修饰组学（磷酸化修饰鉴定）
❶ 精准识别：IP-MS锁定互作靶点
● 技术流程：利用特异性抗体从细胞中富集PCK1蛋白复合物，然后通过LC-MS/MS鉴定复合物中的所有成员及其磷酸化修饰。
● 核心发现：直接发现了PCK1自身的两个关键磷酸化位点（S90和T92），并成功将乳酸脱氢酶A（LDHA）鉴定为其特异性相互作用的潜在底物。
❷ 功能验证：修饰组学与生化实验证实机制
● 技术流程：采用磷酸化修饰组学（如TiO2 beads富集）全景式扫描并定量比较不同样本间的磷酸化水平变化，再通过定制磷酸化特异性抗体、点突变及体外激酶实验进行功能性验证。
● 核心发现：证实S90是PCK1的活性开关，其磷酸化直接增强了PCK1的激酶活性以及对LDHA的结合与调控能力，从而将PCK1的激活与下游代谢重编程联系起来。
小结：
研究首先利用IP-MS进行“靶向探索”，锁定激酶与底物的直接相互作用；进而通过磷酸化修饰组学与严谨的生化实验进行“功能验证”，阐明磷酸化事件的分子机制。这套组合策略高效地完成了从“已知激酶”到“未知底物”再到“功能性磷酸化调控”的完整解析。
【该文由谱度众合公司提供IP-MS蛋白互作组研究解决方案。】
二、已知底物找激酶：质谱技术逆向 “追溯” 上游调控者
核心逻辑
从已知底物蛋白出发，通过IP-MS 捕获与底物结合的激酶复合物，利用修饰鉴定蛋白质组学精准定位底物的修饰位点，匹配激酶的底物基序，进而筛选并验证上游调控激酶，破解 “底物已知但激酶不明” 的难题。
质谱技术的核心作用
● IP-MS 直接捕获与底物结合的激酶，无需依赖激酶基序预测，提升筛选准确性；
● 修饰鉴定蛋白质组学精确定位底物的关键修饰位点，为激酶筛选提供 “靶点锚点”；
● 结合体外激酶实验与质谱定量，验证激酶对底物的直接修饰作用。
IF：48.5 | IP-MS联合修饰组学
追溯 SRC-3 底物的上游激酶 PFKFB4
期刊：
Nature（2018）
研究背景：
致癌转录共激活因子 SRC-3在乳腺癌中频繁异常激活，是驱动肿瘤增殖和转移的关键癌基因。其活性依赖翻译后修饰调控，但上游直接调控激酶一直未明确，传统方法既无法锁定其关键磷酸化位点及其上游互作激酶，导致致癌机制解析受阻。
所用质谱技术：
IP-MS（互作激酶筛选）、磷酸化修饰组学（位点鉴定）、质谱定量（体外激酶实验验证）
❶ IP-MS：捕获与 SRC-3 互作的潜在激酶
● 技术流程：通过免疫共沉淀（Co-IP）从乳腺癌细胞中中特异性富集 SRC-3 蛋白及其结合形成的蛋白复合物，将富集得到的复合物进行处理后，采用 IP-MS 技术对复合物中的所有成员进行鉴定，筛选与 SRC-3 直接互作的蛋白。
● 核心发现：从 SRC-3 蛋白复合物中直接鉴定到代谢酶 PFKFB4，证实 PFKFB4 与 SRC-3 存在体内直接相互作用，为后续筛选调控 SRC-3 的上游激酶提供了核心候选分子。
❷ 磷酸化修饰组学：定位 SRC-3 的关键磷酸化位点
● 技术流程：将通过 Co-IP 纯化得到的 SRC-3 蛋白用胰酶消化成肽段，采用磷酸化修饰组学技术对肽段进行检测，精准识别并定位 SRC-3 上的磷酸化修饰位点，同时分析不同实验条件下（如不同葡萄糖浓度培养的细胞）该位点的磷酸化水平变化。
● 核心发现：明确 SRC-3 的 CBP 相互作用域中 Ser857 是唯一被 PFKFB4 特异性磷酸化的关键位点，且该位点的磷酸化水平在高葡萄糖（25mM）培养的乳腺癌细胞中显著升高，在低葡萄糖（5mM）或敲低 PFKFB4 的细胞中显著降低，该位点成为验证激酶 - 底物直接作用的 “靶点锚点”。
小结：
研究先通过 IP-MS 完成 “靶向捕获”，锁定与 SRC-3 互作的潜在激酶 PFKFB4；再利用磷酸化修饰组学定位关键位点 Ser857，以质谱定量验证直接磷酸化关系；最后结合生化实验和体内模型，阐明该激酶 - 底物轴的致癌功能。这套 “捕获 - 定位 - 验证” 的组合策略，高效解决了 “已知底物找激酶” 的核心难题，完整解析了从上游激酶到下游代谢重编程的调控链路。
三、两大研究场景核心研究思路总结
（一）已知激酶找底物：
从 “激酶” 到 “底物” 的正向筛选思路
以 “IP-MS 捕获互作蛋白 + 修饰鉴定锁定靶点” 为核心，依托亲和纯化富集修饰肽段与质谱介导的修饰鉴定，具体步骤如下：
1.样本制备：构建激酶活性差异模型
通过过表达 / 敲除 / 药物抑制等方式，构建激酶激活与抑制的对比样本，确保磷酸化差异仅由目标激酶调控。
2.亲和纯化：精准富集磷酸化肽段
采用 PolyMAC 金属离子亲和捕获、TiO2磁珠富集等技术，从复杂蛋白消化液中高效捕获低丰度磷酸肽，排除非磷酸化肽段干扰，为后续修饰鉴定奠定基础。
3.质谱分析：鉴定修饰位点与候选底物
● 对纯化的激酶 - 蛋白复合物进行 IP-MS 分析，捕获潜在互作蛋白，初步筛选候选底物；
● 利用修饰鉴定蛋白质组学（如磷酸化、乳酸化等），对比活性差异样本的修饰肽段丰度，筛选 “激酶依赖型修饰肽段”；
● 通过基序分析，锁定含激酶特异性修饰基序的候选底物，明确修饰位点。
4.体外验证：确认直接互作
对候选底物进行体外激酶实验，结合质谱定量修饰水平（如磷酸化效率），验证激酶对底物的直接修饰作用；通过修饰位点突变实验，确认该修饰对底物功能的调控，排除间接调控的 “伪底物”。
（二）已知底物找激酶：
从 “底物” 到 “激酶” 的逆向追溯思路
以 “IP-MS 捕获互作激酶 + 修饰鉴定定位锚点” 为核心，依托亲和纯化捕获蛋白复合物与质谱介导的修饰定位 + 激酶鉴定，具体步骤如下：
1.样本处理：聚焦底物蛋白
针对已知底物，通过免疫沉淀（Co-IP）从细胞中纯化底物蛋白及其结合的蛋白复合物，确保捕获与底物直接互作的潜在激酶。
2.IP-MS 分析：鉴定候选互作激酶
对底物 - 蛋白复合物进行 IP-MS 分析，通过质谱定性定量检测，直接鉴定与底物结合的激酶分子，初步筛选候选上游激酶。
3.修饰鉴定：定位关键修饰位点
将纯化的底物蛋白消化为肽段后，利用修饰鉴定蛋白质组学（如磷酸化、乙酰化等）精准定位关键修饰位点 —— 该位点是匹配激酶底物基序的 “核心锚点”，为激酶筛选提供特异性依据。
4.功能验证：证实激酶 - 底物直接作用
● 结合激酶基序数据库，筛选可识别底物修饰位点的候选激酶；
● 用重组候选激酶与底物（含野生型 / 修饰位点突变体）进行体外激酶实验，通过质谱定量修饰效率，确认激酶对底物的直接修饰作用；
● 再通过 IP-MS 验证候选激酶与底物的结合依赖于该修饰位点，最终锁定上游调控激酶。
四、总结：IP-MS + 修饰鉴定是激酶 - 底物互作研究的 “核心引擎”
无论是正向筛选已知激酶的下游底物，还是逆向追溯已知底物的上游激酶，IP-MS 联合修饰鉴定组学都以 “精准捕获互作 + 明确修饰位点 + 验证直接作用” 的核心优势，成为破解激酶 - 底物互作难题的 “科研利器”。它不仅能剔除假阳性、避免传统方法的低效，更能还原真实的信号调控网络，为基础研究与药物靶点筛选提供关键支撑。
推荐
在实际研究中，你的研究是否正被“激酶找不到底物”“底物追不到激酶” 所困扰？是否正需要精准的磷酸化位点鉴定、激酶 - 底物互作验证支持？无论是从已知激酶 “正向筛选” 底物，还是从已知底物 “逆向追溯” 激酶，IP-MS 结合修饰鉴定蛋白质组学早已成为破解激酶 - 底物互作的核心工具。
谱度众合作为由武汉大学博士团队创办的科研服务企业，恰好能为你解决这些痛点 —— 专注于利用 IP-MS、磷酸化等修饰鉴定质谱技术，服务于生物标志物发现、药物靶点筛选及基础蛋白质研究（如激酶 - 底物互作解析），在该细分领域持续深耕十几年。针对 “已知激酶找底物”“已知底物找激酶” 等具体研究场景，我们开发了多种贴合研究目的与论文发表需求的服务产品，助力你更轻松、高效地完成科研目标，让激酶 - 底物互作研究不再受技术瓶颈制约。
联系丸子，了解更多~
参考文献
[1] Arrington JV, Hsu CC, Tao WA. Kinase Assay-Linked Phosphoproteomics: Discovery of Direct Kinase Substrates. Methods Enzymol. 2017;586:453-471. doi:10.1016/bs.mie.2016.11.005
[2] Zhu J, Xiong Y, Zhang Y, et al. Simvastatin overcomes the pPCK1-pLDHA-SPRINGlac axis-mediated ferroptosis and chemo-immunotherapy resistance in AKT-hyperactivated intrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer Commun (Lond). 2025;45(8):1038-1071. doi:10.1002/cac2.70036
[3] Dasgupta S, Rajapakshe K, Zhu B, et al. Metabolic enzyme PFKFB4 activates transcriptional coactivator SRC-3 to drive breast cancer. Nature. 2018;556(7700):249-254. doi:10.1038/s41586-018-0018-1
关键词： 找不到激酶底物？找不到底物激酶？一篇教会你！
相关资讯
双喜临门！谱度众合连获2026年“武汉市人工智能企业”和“武汉市大数据企业”双项殊荣
2026-07-30
谱度众合亮相贵州大学溪山生物医药创新论坛：高通量质谱技术驱动药物靶点精准筛选
2026-07-30
科研不容试错，标准铸就信任！谱度众合PRM靶向检测省级团体标准正式获批！
2026-07-30
二十年质谱技术沉淀助力于您的蛋白质研究
谱度众合是一家由武大生科院博士师兄弟创办的科研服务企业，团队延续课题组方向持续深耕专业领域20年，一直专注于利用质谱技术服务于生物标志物发现、药物靶点筛选、分子机制解析等研究领域，致力于为生物医学科研工作者提供靠谱的高效率科研工具。
业务咨询