这是最直接的第一步。体外转录出生物素标记的靶RNA，跟细胞裂解液孵育，让RNA去"钓"蛋白，然后用链霉亲和素磁珠把RNA-蛋白复合物拉下来，最后用候选蛋白的抗体做Western blot检测。

原理不复杂，但对照一定要做好。最关键的阴性对照是反义链RNA或者一段无关RNA —— 如果你的候选蛋白在反义链组也被拉下来了，那大概率是非特异性结合。Input组也要留，看蛋白在裂解液中的表达量，避免"拉下来是因为表达高"的假象。

这个方法能证明的是：在体外体系中，你的RNA和蛋白可以发生结合。注意是"体外"，而且不能区分直接结合还是通过第三个分子间接结合。

图1  RNA pull-down实验流程示意图。

正向是用RNA钓蛋白，反向就是用蛋白钓RNA。

用候选蛋白的特异性抗体，把细胞内天然状态下的蛋白-RNA复合物一起沉淀下来，然后提取RNA，用qPCR（已知靶标）或测序（未知靶标）检测你的靶RNA有没有被富集。

RIP的价值在于它是在细胞内生理条件下做的，比体外pulldown更接近真实情况。

无法区分直接结合和间接结合 —— 蛋白可能通过另一个蛋白或RNA复合物间接拉到靶RNA。

IgG同型对照看非特异富集，Input组看起始RNA丰度，最好再加一个已知不跟该蛋白结合的RNA做阴性对照。富集倍数一般用ΔCt法计算，即IP组相对于Input组的富集量，再跟IgG组比较。

体内RIP和体外RNA pull-down要互相佐证，两套体系结果一致，互作结论才站得住脚。只做一个方向，审稿人很可能会提。

图2  RIP实验流程示意图。用靶蛋白抗体富集细胞内天然RNP复合物，经洗涤、洗脱后提取RNA，通过qPCR或RNA-seq检测互作RNA。

两个分子要互作，前提是它们得在同一个地方出现。

RNA FISH（荧光原位杂交）可以标记靶RNA在细胞内的位置，免疫荧光标记候选蛋白，两者叠加后用共聚焦显微镜看有没有共定位。

现在常用的是Stellaris单分子FISH探针，灵敏度高，能看到单个RNA转录本。如果靶RNA主要在细胞核，而候选蛋白只在细胞质，那这俩大概率不是直接互作 —— 当然也不排除蛋白在特定条件下发生转位，但至少说明需要更多证据。

定量方面，不要只放一张图说"有共定位"，最好算Manders共定位系数（M1/M2）或者Pearson相关系数，用数据说话。Costes随机化检验可以排除偶然重叠的假阳性。

要强调一点：共定位只是互作的必要条件，不是充分条件。两个分子在同一个区域，不代表它们直接结合。共定位是重要的旁证，但必须结合前面的生化实验一起看。

图3  RNA FISH与免疫荧光共定位示例。HER2 mRNA（绿色）与HER2蛋白（粉色）在人SK-BR-3细胞中同时检测，DAPI（红色）标记细胞核，可见mRNA与蛋白在胞质中共定位。（图片来源：LGC Biosearch Technologies）

前面三步回答的是"有没有结合"，截短实验回答的是"哪里结合"。这一步对于后续机制研究很重要，也是高分文章经常要求的。

把靶RNA切成几段（比如5'端、中间、3'端，或者按预测的茎环结构切），分别做pulldown，看哪一段能拉到蛋白。逐步缩小范围，最后定位到几十碱基的核心结合区。

构建候选蛋白的不同结构域缺失突变体（比如去掉RRM结构域、去掉KH结构域），转染细胞后做RIP，看哪个结构域缺失后RNA富集消失了。如果蛋白有已知的RNA结合域，优先验证；如果没有，可能发现新的结合界面。

更严谨的做法是在定位到核心区域后，再做关键碱基或氨基酸的点突变，看突变后结合是否丧失 —— 这才是真正的"功能获得/丧失"证据。

如果前面的实验都支持互作，想进一步证明是"直接结合"，EMSA是最经典的方法。

把纯化的重组蛋白和标记的RNA探针（生物素或放射性标记）在体外孵育，然后跑非变性聚丙烯酰胺凝胶。蛋白结合RNA后，复合物分子量变大，迁移速度比游离RNA慢，就会出现一个"shift"条带。

做EMSA有几个要点：

随着蛋白浓度增加，游离RNA条带逐渐减弱，shift条带逐渐增强，这种剂量依赖性是特异性结合的标志，还能用来算解离常数Kd。

加入过量未标记的同源RNA应该能竞争掉shift，而加入无关RNA则不能，这证明结合是序列特异性的。

抗体跟蛋白结合后让复合物迁移更慢，进一步确认shift条带里的蛋白就是你的靶蛋白。

EMSA是证明直接结合最严格的证据，但它的局限也很明显：需要纯化的有活性的重组蛋白，很多蛋白纯化后可能折叠不正确或者丢失了辅助因子；而且是体外条件，跟细胞内真实环境有差距。所以EMSA通常作为"压箱底"的证据，跟体内实验配合使用。

图4  EMSA实验原理与结果示意图。标记RNA探针与蛋白孵育后，复合物迁移慢于游离探针（Shift）；加入特异性抗体可产生Supershift，用于确认蛋白身份。

证明了RNA和蛋白确实结合，接下来要回答的问题是：这个结合有什么用？很多互作可能只是"物理接触"，并不产生生物学效应。功能验证就是要把互作和表型挂起钩来。

敲低或者过表达靶RNA后，重复RIP实验，看候选蛋白的富集是否相应减弱或增强。如果RNA少了，蛋白拉下来的RNA也少了；RNA多了，富集也跟着增加——这种剂量依赖性的对应关系，是互作真实性的又一层保障，也能排除一些实验假象。

反过来，敲低或过表达候选蛋白，看靶RNA的行为有没有变化。比如RNA的稳定性是不是变了（用Actinomycin D chase实验测半衰期）、亚细胞定位是不是变了、翻译效率是不是受影响了。如果这个蛋白真的是RNA的功能执行者，改变蛋白水平应该能观察到RNA功能的相应变化。

最终还是要落到表型上。敲低RNA或者蛋白后，细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭等表型有没有变化？更关键的是挽救实验（rescue experiment）：同时敲低RNA并过表达蛋白（或者反过来），看表型能不能被挽救回来。如果两者在同一条通路上，挽救实验应该能部分或完全恢复表型。这是证明"RNA通过这个蛋白发挥功能"的最有力证据。

不是每个候选蛋白都需要把上面所有实验做一遍。根据研究深度和目标期刊，合理选择组合：

表1  RNA互作蛋白验证方法层级与证据强度

一般来说，做到"pulldown + RIP + 共定位"这三步，就能支撑一个比较扎实的互作结论了。如果要冲高分期刊，再加上截短定位和EMSA。功能验证则根据课题需要，至少要做到表型变化，挽救实验是加分项。

最后提醒几个常见的坑：

第一，不要只做一个方法就下结论，正向反向、体内体外交叉验证才可靠；

第二，对照不能省，IgG、反义链、Input这些对照是审稿人第一眼就看的；

第三，不要把共定位当直接结合，空间共存只是前提；

第四，体外实验结果要谨慎解读，体外能结合不代表体内一定结合，反之亦然。

质谱给你的是候选名单，验证实验才是真正的"试金石"。把这套流程走一遍，你的互作结论就经得起推敲了。

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