筛出上千个“无名”小分子，如何通过对接＋SPR把验证范围缩小到个位数
所属分类： 技术干货
发布时间： 2026-10-16
概要： “我对靶点A和B做了一轮虚拟筛选，软件吐出几百个新分子，很多连个俗名都没有，只有一串SMILES。
这是上个月一个客户在电话里问我的原话。类似的问题，我在项目上被问过不下十次。刚跑完虚拟筛选的人很容易卡在这一步：计算侧看起来产出很大，但湿实验预算有限，一个化合物从定制合成到拿到毫克级样品，少说几千块、几周时间。如果抱着“先买二十个筛筛看”的心态，大概率会发现——二十个里面真正和靶点有特异性结合的，可能一个都没有。
我们团队这些年跑过不少基于结构的虚拟筛选（SBVS）和基于配体的筛选（LBVS），踩过的坑最后都收敛成一套流程：先清洗假阳性 → 再做精细对接和重打分 → 用成药性漏斗收敛到1~2个分子 → 最后上SPR直接测结合。这篇文章把这套流程拆开讲，重点说哪些地方容易选错、怎么判断。
图1 从SMILES到SPR验证的四阶段筛选漏斗
一、“没名字”很正常——SMILES就是它的身份证
先说一个很多新手不知道的事实：ZINC、PubChem、ChEMBL这些库里的分子，绝大多数从来没有INN（国际非专利药品名称），也没有商品名。一个分子只在文献里出现过一次、连晶型都没定过，厂家根本不会给它起名字。
所以看到一串ZINC ID（比如我们做马尔堡病毒VP40蛋白时拿到的ZINC95457352、ZINC38752258、ZINC38752253）或者一长串SMILES，不用慌。这两样东西就是它的“法定身份证”：
SMILES（简化分子线性输入规范）用一维ASCII字符精确记录了分子的二维连接、键级和手性中心。把它粘进PubChem或ChEMBL，能查到分子量、结构式；粘进Schrödinger Maestro的LigPrep，直接生成带三维坐标的配体模型。
ZINC ID / ChEMBL ID对应数据库里的唯一记录，能查现货库存、合成周期，也能反查有没有人做过活性测试。
实际操作里，我一般会先把初筛出来的分子统一过一遍结构标准化：用OPLS-3力场加氢、补部分电荷、保留已知手性中心，每个配体生成最多64个低能立体异构体，再做几何优化。这一步看起来琐碎，但后面对接打分偏差经常就是因为配体构象没优化好。
二、最容易踩的坑：胶体聚集物，不是真结合
这一节我想多讲两句，因为这是我们团队踩过最贵的一个坑。
高通量筛选里，真正的阳性分子只占库的0.01%~0.1%。但很多人不知道的是：初筛看到的“阳性”结果里，95%以上根本不是分子和靶点真结合，而是化合物自己的理化性质在搞鬼。
两类假阳性，性质完全不同
PAINS（泛测定干扰化合物）：
分子里带某些高反应性亚结构，会共价修饰蛋白半胱氨酸、做氧化还原循环、螯合金属，或者直接把荧光素酶报告基因压下去。这类用子结构过滤器就能拦掉大部分。
SCAMs（小分子胶体聚集物）：
更隐蔽。分子在水相里一过临界聚集浓度（CAC，机理和表面活性剂的CMC类似），就自组装成60~300 nm的纳米胶束。蛋白被物理吸附在胶束表面，发生局部变性——测出来就像“抑制活性”。
数据上有多夸张？Ferreira等人做的定量高通量筛选（qHTS）归因分析发现，全部假阳性里88%是胶体聚集物，荧光干扰只占3.1%。Babaoglu等人在β-内酰胺酶反筛实验里更极端：95%的初筛阳性是SCAMs，最后确证的真阳性不到4%。
怎么一眼认出胶体聚集物
我们实验室现在看到下面这几种信号，直接把分子丢进“待剔除” pile，不会再往下算：
剂量反应曲线特别陡，Hill斜率明显大于1.5。极端例子：SARS-CoV-2老药新用筛选里，钙通道阻滞剂乐卡地平（Lercanidipine）在无去污剂条件下对苹果酸脱氢酶的Hill斜率达到2.9——这是典型的胶束吸附特征，不是特异性结合。
构效关系（SAR）是平的：改一点基团，活性几乎不变。真正的配体不会这样。
加一点点非离子去污剂（0.01% Triton X-100），“活性”直接消失。
分子芳香环特别多、疏水表面积大——这类在对接里往往拿到特别漂亮的范德华打分，但那是胶束前体，不是真结合。
更麻烦的是：这些分子如果没过滤就送去做SPR，胶束会不可逆地沉积在芯片金膜上，产生巨大的假响应信号，把固定了珍贵靶点蛋白的芯片直接废掉。一张CM5芯片加上纯化好的蛋白，成本不低，这个亏我们吃过一次。
我现在的流程是在对接之前，把所有分子的SMILES跑三个在线工具：
ChemFH（https://chemfh.scbdd.com/）：
一站式识别胶体聚集、自发荧光、荧光素酶抑制和反应性干扰。
SCAM Detective（https://scamdetective.mml.unc.edu/）：
北卡大学基于AmpC β-内酰胺酶和Cruzain的去污剂敏感数据训练，对胶体聚集的预测准确率比老方法分别高约53%和46%。
BAD Molecule Filter：
用验证过的0.45作为分类概率阈值，预测概率高于0.45的直接判为Class 1聚集物，提前剔除。
这一步会筛掉库里面相当一部分分子，但不要心疼——留下来的才是值得花算力的。
三、分子对接：别只盯打分那一个数字
洗完假阳性，剩下的分子才进入正式对接。这一步的目标不是“找出分数最高的”，而是找出结合能合理、构型讲得通、对两个靶点选择性符合你实验目的的分子。
1. 先把对接协议验证好，否则后面全是白算
在正式跑库之前，我们一定会做两件事：
共结晶配体回接（Re-docking）：
把蛋白原来带的配体（比如黄嘌呤氧化酶、PAF受体5ZKP里的槲皮素、雪松醇、海风藤酮）抽出来，在同样的Grid Box里重新对接回去。拿到的最佳构象和晶体构象叠合，算RMSD。RMSD压不进理想阈值（一般2 Å以内），说明你的口袋定义或参数有问题，先调协议。
富集测试（Enrichment testing）：
在测试集里混进已知活性化合物和大量无活性的“诱饵分子”（decoys），确认打分函数能把真活性排在前面。
蛋白结构方面，优先用PDB里高分辨率的X射线、冷冻电镜或NMR结构。没有实验结构才用同源建模或AlphaFold模型，后者做出来的对接结果我会保守解读。口袋定义可以用共结晶配体为中心画Grid Box；没有共结晶配体时，用几何口袋探测算法或能量映射找，重点看口袋体积、形状、疏水性和电荷分布。
2. 打分函数不是真理，要知道它的脾气
现在主流对接软件的打分函数分三类，各有盲区：
最关键的一个经验：打分函数天然偏好大分子量的分子。重原子越多，范德华接触项累加越多，分数就越好看。所以我不会只看对接分数本身，而是同时算配体效率（Ligand Efficiency, LE）——单位重原子贡献的结合能。一个分子量600、打分为-11的分子，未必比分子量300、打分为-7的分子好。
3. 人工看构象（Pose Inspection）不能省
分数排前面的分子，我会逐个打开3D相互作用图看：
配体是不是真的插进了活性口袋，而不是浮在口袋表面？
和关键催化残基形成的氢键、盐桥几何角度合不合理？距离太长、角度太歪的氢键不算数。
有没有局部不利相互作用把整体分数抵消掉？比如我们做幽门螺杆菌莽草酸激酶和II型脱氢奎尼酸酶时，丁香酸整体结合趋势看着不错，但和ARG57形成的盐桥反而拉低了分数——这种图上一眼就能看出来。
4. A和B两个靶点怎么交叉选
客户提到同时筛了A和B，这里策略取决于你的研究目的：
想找双靶点/多靶点抑制剂：
找在A和B两个靶点里分数都高、LE都好的分子。比如我们做幽门螺杆菌5个靶点筛选时，龙胆酸（Gentisic acid）能同时高亲和力结合4个靶点，球姜酮A（Zerumin A）、原儿茶酸、没食子酸能同时作用3个靶点。PirA和PirB双毒素项目里，我们也是分别挑出Top 3再交叉印证。
想做选择性化学探针：
反过来找在A里结合好、在B里因为口袋位阻或电荷排斥分数特别低的分子。这才叫选择性，不是两个都结合好。
四、从几十个收敛到1~2个：重打分＋成药性漏斗
初对接后剩下几十分子，离湿实验还差几步。我会在对接之后串三个东西：MM-GBSA重打分 → DFT/MD动力学验证 → ADMET和合成可及性过滤。
1. MM-GBSA：补上对接没算准的溶剂化
刚性对接在溶剂化效应上估算比较粗。对接排名前几的分子，我会用Schrödinger Prime跑MM-GBSA（分子力学-广义玻恩表面积）重新算结合自由能。这一步会刷掉一批对接好看但热力学不稳定的构象。
2. DFT和MD：从电子结构和时间演化两个角度复核
DFT前线轨道：
算HOMO-LUMO能隙。能隙太小的分子极化率高，化学反应性过强，非特异结合风险大；能隙适中才是电子稳定的候选。
全原子MD模拟：
对前几个复合物跑100 ns。在长时间水合环境里保持低RMSD波动、不逃出口袋的分子，才敢送去做实验。黄嘌呤氧化酶项目最后胜出的山柰酚-3-O-葡萄糖苷和七叶苷，就是这么跑出来的。
3. ADMET和成药性：别等做了细胞实验才发现分子过不了膜
把SMILES粘进SwissADME、pkCSM、Molsoft、ProTox-3.0，一次过一遍：
Lipinski五原则：
MW<500、logP<5、HBD<5、HBA<10、可旋转键<10。
扩展成药性规则：
Ghose、Muegge、Veber、Egan，全部过一遍。
急性毒性：
ProTox分级，优选Class 5（可能有害）和Class 6（无毒），Class 1~3的骨架直接排除。
对接锁定了X4到X11共8个高分分子。Lipinski一算，X6（HBA=16、HBD=10）和X7氢键供受体严重超标，直接淘汰。剩下的X4、X5、X8~X11不仅过了Ro5，Ghose/Muegge/Veber/Egan四项也全过。
对“没名字”的分子，还有一个特别实际的指标：合成可及性评分（SA Score）。X4、X5、X8、X9、X10、X11的SA评分分别是3.11、3.16、3.62、3.62、3.26、3.30——都在易合成区间，委托合成几周就能拿到毫克级干粉。SA评分高的分子就算对接分数再漂亮，合成周期半年起，前期项目我不会选。
图2 SPR芯片固定方式对比与DMSO溶剂校正前后信号
五、SPR：最后一步的直接结合确证
计算侧收敛到1~2个分子、拿到实体样品后，就进入我认为整个流程里最关键的湿实验环节——SPR（表面等离子体共振）。和酶活或细胞表型不同，SPR是无标记、实时测分子和蛋白的直接结合，能同时拿到亲和力（KD）和动力学参数（kon、koff）。
1. 先搞清楚Rmax：小分子SPR和你想的不一样
小分子分子量通常只有几百Da，而靶点蛋白是几万Da。这意味着——小分子结合产生的SPR响应信号特别小，通常只有几十到一两百RU（Response Unit），和蛋白-蛋白互作动辄上千RU完全不是一个量级。
实验设计上有一条定量关系必须提前算清楚：
Rmax（理论最大响应）= RU固定量 × (小分子MW / 蛋白MW) × 化学计量比
因为小分子分子量小，Rmax天然就低。如果实测的饱和响应和理论Rmax差了好几倍，基本就是分子在芯片上发生了非特异沉积或胶束聚集——这个信号本身就是假阳性的实锤。我们在逆转录酶小分子抑制剂项目里，就是通过把蛋白固定量提高到合适水平，再用分子量比例反推合理Rmax范围，来判断1:1结合是否成立的。
2. 芯片固定：选共价偶联还是定向捕获
这是SPR成败的第一步。固定方式选错了，后面数据全废。
做GPCR这类容易失活的膜蛋白，我一定会用定向捕获而不是共价偶联。CB2受体项目里，Twin-Strep-tag融合蛋白在含10%甘油的缓冲液里、200 nM浓度下就能实现近乎不可逆的捕获，蛋白活性保持得比共价固定好太多。
3. DMSO溶剂校正：不做这一步，数据全是假的
小分子溶解度差，母液必须用DMSO配。但DMSO折射率很高，样品和缓冲液之间哪怕DMSO浓度差0.1%，进样瞬间就会产生巨大的体相信号跳变（bulk shift），把真正几十RU的结合信号完全淹没。
按Biacore Assay Handbook的标准做法：
实验序列里插入一组DMSO浓度略有差异的空白校正循环。
用Biacore T200/8K或带X100 Plus Package的分析软件自动拟合校正方程（注意：老款Biacore 3000没有自动溶剂校正，要手动建校准线）。
运行缓冲液里常规加非离子去污剂（直接用HBS-EP+或PBS-P+，自配则补0.01% Triton X-100），从物理上瓦解胶束。
4. 动力学采集和拟合
多循环动力学的标准程序我们一般这么设：
60秒缓冲液基线稳定 → 300秒小分子结合 → 600秒缓冲液解离。
用Fc1做空白参比或固定无关蛋白（IgA、HSA），Fc2/Fc3分别固定靶点A和B，一针进样同时拿到双靶点数据，做double-referenced扣减。
最高浓度接近平台期的数据用稳态亲和力模型拟合；最高浓度还没饱和的弱结合分子，根据固定量和阳性对照反推合理Rmax，用1:1动力学模型拟合kon、koff。
六、行动路线
把整套流程压缩成可执行的清单，下次筛完分子照着走就行：
第1步 · 身份解析＋假阳性清洗：
SMILES/PubChem确认结构；ChemFH + SCAM Detective + BAD Molecule Filter（阈值0.45），剔除占假阳性88%~95%的胶体聚集物和PAINS。
第2步 · 对接＋人工构象审查：
先做回接RMSD验证和富集测试；对接同时看GlideScore/Vina分数和配体效率LE；逐个人工检查氢键、盐桥和不利相互作用；按A/B双靶点目的选择共性分子或选择性分子。
第3步 · 收敛到1~2个：
Prime MM-GBSA重打分；DFT算HOMO-LUMO能隙；100 ns MD看稳定性；SwissADME/pkCSM/ProTox过Ro5＋扩展规则＋毒性分级；看SA合成可及性评分，选易合成的。
第4步 · SPR直接确证：
按蛋白稳定性选EDC/NHS或定向捕获；控制固定量让理论Rmax落在合理范围；必做DMSO溶剂校正；缓冲液加去污剂；多循环动力学采集，双参比扣减后拟合KD/kon/koff。
这套流程跑下来，虽然计算和准备工作比“直接买二十个筛”多花一两周，但你最后送进SPR的1~2个分子，是经过多层物理和化学筛选的真候选，而不是花掉几万块采购费后才发现是胶束假象。对刚拿到筛选结果、预算有限的项目来说，这才是真正省钱的路径。
参考资料
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关键词： 筛出上千个“无名”小分子，如何通过对接＋SPR把验证范围缩小到个位数
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