蛋白组和转录组为什么会结果不一致？

做联合分析之前，先把预期摆正。大规模平行测同一批样本的mRNA和蛋白质，相关系数通常为0.2–0.5。这个数字并非仅源自某一篇文章的结论，而是被反复验证的经验区间。

我把自己印象比较深的几组队列数据列一下：

一个值得注意的数量级问题：

转录组的动态范围大约跨4个数量级，蛋白质组则为8个。两者的“量纲”不在一个尺度，因此无法点对点对齐。因为，转录组反映的是某一时刻的转录输出，蛋白质组反映的是经过翻译与选择性降解后的终末丰度，两者之间隔着转录后调控、翻译、降解一整套过程。

原因可以归成两大类：细胞自身的生物学调控，和我们手上仪器的技术局限。下面分开讲。

mRNA半衰期通常为几分钟到几小时，但蛋白质相对稳定，几十小时到几天都较为常见。

我们曾做过的一个药物时间梯度项目：

加药后2小时收样，转录组里很多应激基因上调十几倍，但其对应的蛋白丰度几乎没有变化。原因是蛋白从合成到累积到新的稳态，滞后以小时计。在2小时这个时间点做横截面采样，转录组反映的是即时转录反应，蛋白组反映的是过去十几个小时的累积结果 —— 两个时间尺度的测量无法直接对齐。

做时间序列设计时，这个时间差一定要留够。早期时间点的转录组和同期蛋白组对不上，九成是这个原因，不是仪器坏了。

很多人默认“mRNA多，蛋白就多”，是线性关系。实际上并非如此。

Schwanhäusser的经典动力学测算显示：单个细胞的平均蛋白拷贝数大约为17万个；而一个mRNA分子，平均翻译近9800个蛋白拷贝，最大翻译率甚至能达到每小时合成近千个蛋白。由此可见，不同基因之间，翻译效率相差好几个量级。

更关键的是，该模型发现翻译速率和mRNA丰度不是简单正比：mRNA越高的基因，单条mRNA被翻译得越“卖力”，蛋白水平是被指数式放大的，放大指数受基因自身序列特征调控。后来还有从进化适应度角度建立的模型：细胞在转录成本（和mRNA拷贝数挂钩）与翻译成本、蛋白毒性之间找平衡，推出来的mRNA-蛋白缩放指数下限是0.5——蛋白越容易有毒的基因，越要靠堆mRNA来压住噪声。

一句话：mRNA丰度只是蛋白丰度的一个起点参数，中间隔着翻译效率这个大变量。

这是近几年CPTAC大数据里我觉得最有意思的发现。研究者把基因按“蛋白丰度谁说了算”分成两类：

蛋白水平主要由自己的转录本决定。这类基因mRNA半衰期短、反应快，RNA丰度确实能较好地预测蛋白，比如一些独立工作的酶、应激蛋白。

蛋白水平不依赖于mRNA，而依赖于其互作蛋白的表达量。典型代表是核糖体亚基蛋白：合成后，若无法组装成稳定的多聚复合物，会立刻被泛素-蛋白酶体系统清除。

核糖体亚基是最典型的例子：一个核糖体有八九十种蛋白，得按化学计量学严格配齐。你把其中一种的mRNA敲高两倍，其他七种没跟上，多出来的那部分根本留不住，当场降解。这时候你测它的mRNA涨了、蛋白没动，太正常了——不是技术问题，是蛋白组装不下你多给的那一份。

单细胞层面的研究也印证了这件事：这种蛋白清理机制，是维持单细胞蛋白稳态、也是让单细胞蛋白共变异模式和转录组脱节的关键原因。

即转录组检测到mRNA存在显著变化，但细胞在翻译层面或者蛋白降解层面发生反向代偿，导致最后蛋白输出基本不变。

有研究把转录组、翻译组和蛋白组放一起做张量分解，确实捕获到两种模式：

mRNA和翻译信号都涨，蛋白反而降；

蛋白波动幅度远小于mRNA。

这说明细胞对关键通路（比如氧化磷酸化、蛋白稳态）在翻译层主动抑制转录波动。

所以当看到大量mRNA变化但其蛋白水平不受影响，可以考虑这组基因是不是在缓冲阶段。

使用TMT、iTRAQ这类等重标签做定量，需要先了解“比值压缩”。

DDA模式下，母离子选择窗口一般为0.4–1.2 Th。窗口里除了目标肽段，还存在质量和保留时间相近的背景肽段。二者在各个TMT通道里几乎是1:1等量分布的，因此目标肽段真实的组间差异，会被背景信号一稀释，测出来的差异会比实际偏小。

转录组里清楚上调数倍的基因，到蛋白组里FC压得很小，过不了差异阈值。你以为是翻译缓冲，其实是仪器把真实差异压缩了。

❶ FAIMS（高场不对称波形离子淌度）作为离子接口加在Orbitrap上，靠淌度差异把干扰肽挡在外面。文献里报过，嵌合MS/MS谱图比例能从50%降到27%，TMT比值压缩明显缓解。

❷ TIMS-PASEF（布鲁克平台）把离子淌度和质量关联起来，测序速度和灵敏度都上来了，还清掉一堆单电荷化学噪声，检测下限推到pg级——这也是单细胞蛋白组能起来的硬件基础。

❸ RTS-SPS-MS3（赛默飞）走MS2之后先实时在数据库里搜一遍，确认是哪条肽段，再触发高分辨MS3来提取标签定量，专治比值压缩，同时保留蛋白覆盖率。

图1  TMT等重标签定量中的比值压缩。共分离的背景肽段在各通道近似1:1分布，把目标肽段的真实倍数差异稀释、压缩（示意图）。

这是我现在给客户做方案时必讲的一点：

随机挑强度高的母离子打碎。扫描速度有限，大批低丰度肽段经常被漏掉，跨样本缺失值多，定量CV普遍高于15%。缺失值一多就得做人手填补，一填补就引入噪声，多组学一整合，假不一致就出来了。

把质荷比窗口按宽带系统扫一遍、全部碎裂存档。数据完整性通常能到78%以上，CV普遍压到10%以内，低丰度蛋白抓得住，重现性好。文献里反复验证过，DIA定量出来的蛋白-mRNA相关性比DDA高。

做大队列多组学，我现在基本首选DIA。DDA只在追求深度鉴定、样本量小的时候考虑。

实体瘤样本存在很强的空间异质性，即把一块瘤组织分为两部分，一半提取核酸、一半提取蛋白，但这这两部分的细胞群分布可能不一样。这种“人为不一致”在数据处理阶段无法被发现，导致最后呈现“生物学不一致”。

正确做法是用共提取流程：从同一份匀浆裂解液里先后把RNA和蛋白分出来，确保测的是同一个生物学实体。做临床样本的人，这一步能避免大量后续无法回溯的系统偏差。

在单细胞层面：scRNA-seq存在“细胞一分散开，转录组噪声巨大”的问题。

造成这个局面的原因：单个细胞里绝大多数基因的mRNA拷贝数就个位数，但转录过程属于爆发式进行，数据会被泊松噪声主导。

但等超高灵敏度的单细胞蛋白组（SCoPE2这套思路：mPOP微量前处理加CellenONE挑细胞、TMT/TMTpro标记，配合TIMS-qTOF）真正测进去之后，看到的东西反直觉：不管细胞在分化还是在受扰动，单细胞里有一套高度稳定、被严格调控的“核心蛋白组”，而同批细胞的转录组倒是剧烈波动。这说明仅凭转录组数据推断单细胞功能表型是存在系统性偏差的。

既然mRNA≠蛋白，那测“正在被翻译的mRNA”不就桥接了吗？这就是Ribo-seq（核糖体图谱）。

RNA-seq测的是总mRNA，里面混着P小体里被封存、根本不翻译的部分。Ribo-seq用核酸酶消化，把真正被活性核糖体包住的那段28–32个核苷酸的RPF富集出来测序，还自带三核苷酸周期性，即哪条mRNA此刻正在被翻译延伸。

桥接效果是立竿见影的：

这完全匹配了转录组和蛋白组之间的“不一致”，说明主要原因在于翻译效率。而Ribo-seq通过单独计算翻译效率，就能实现转录事件和翻译调控事件的分别呈现。

附带一个福利：Ribo-seq是密码子级分辨率，能挖出很多常规参考序列里没有的东西——非经典翻译起始位点、短开放阅读框（sORF）、上游开放阅读框（uORF）编码的多肽。把这些做成定制化搜索库喂给质谱，能找到Swiss-Prot里根本没有的“暗物质”蛋白。

联合分析做完，大家都会画九象限图：X轴是mRNA的log2 FC，Y轴是蛋白的log2 FC，切九个格。我自己看这张图的习惯是，先别急着找“一致区”的基因，先看那些“不一致”的格子——那里才是信息。

转录和蛋白同涨同跌，说明这组基因是转录层硬调控的，比如转录因子直接控制的效应通路。这些是做功能验证最省心的候选，RNA是蛋白的好预测。

RNA涨了蛋白反而跌，或者反过来。最经典的解释是蛋白正在被急速降解——细胞为了补回被清掉的蛋白，代偿性地把mRNA往上调。这里面可能藏着泛素-蛋白酶体被靶向激活的线索。

mRNA稳着，蛋白变了。这就是前面说的“互作驱动型”蛋白——复合物里某个亚基变了，化学计量失衡，整组蛋白跟着累积或降解。药物诱导降解、RNA结合蛋白抑制翻译，也都落在这。

蛋白水平无变化。这是典型的翻译缓冲现象；也可能是非编码剪接变异体，RNA-seq数到了但根本不翻译成蛋白。

做了这么多年多组学，我自己的体会是几句话：

转录组告诉你细胞“打算干什么”，蛋白组告诉你细胞“实际在干什么”。这两句话之间的缝隙，就是我们做蛋白组的人要去填的地方。

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参考资料