我的蛋白WB明明能看到，为什么质谱却“没打到”？

聊"低丰度"之前，得先搞清楚质谱究竟能测到多低。

文献里的数据表示：1. 理想条件下；2. 纯品肽段或蛋白直接进样，没有复杂背景，一台高分辨质谱（如Orbitrap系列）的检测限约480 fg，换算成物质的量约10 amol（10×10^-18mol）。对一个50 kDa的蛋白来说，这相当于约600万个分子。

大家可能觉得600万个分子已经很少了。但注意，这还是"理想条件"，其实在真实的复杂样本中（比如常用的细胞裂解液、组织匀浆、血浆）—— 这个数字会大打折扣。

用靶向方法（PRM/SRM）灵敏度还能再提高。比如，有研究在Quadrupole-Orbitrap上用SIM模式，注射量低至0.035 amol的肽段仍可检测到，所以靶向方法在复杂基质中的检测，通常比非靶向DDA灵敏5-10倍。

我早年做过一个印象很深的实验：纯化的激酶蛋白稀释到不同浓度跑质谱，1 fmol级别峰图很漂亮；但把同样量的激酶加到HeLa裂解液里再跑，信号直接被淹没，MS/MS质量差到搜库都搜不到。同一个蛋白、同一台仪器、同一个上样量，就因为背景复杂度不同，结果天差地别。

所以看到文献里写"检测限X amol"时，一定要看清楚是在什么基质中测的。纯品检测限和复杂样本的实际检测能力，完全是两码事。

我们以人血浆为例，从白蛋白（35-50 mg/mL）到细胞因子（pg/mL级别），跨度居然超过了12个数量级。在细胞裂解液里面虽然没有这么夸张，但里面存在的高丰度蛋白（肌动蛋白、代谢酶）和低丰度的信号蛋白、转录因子之间，差7-8个数量级也很常见。

典型值是4-6个数量级。也就是说，仪器的"视野"只能同时看到丰度最高和最低之间差一万倍到一百万倍的蛋白。超出这个范围的，要么高到饱和失真，要么低到看不见。

图1  蛋白质丰度动态范围与质谱检测范围对比。

这个差距说明在未经处理的血浆样本里面，白蛋白、IgG这些高丰度蛋白占据了质谱的大部分信号和采样时间，而低丰度蛋白（很多恰恰是疾病标志物候选）就根本没有机会被看到。

我做血浆蛋白质组学时深有体会。不去高丰度蛋白，一次DDA能鉴定到的蛋白可能就两三百个，翻来覆去都是那批高丰度的。用IgY-12或Seppro柱去掉Top14之后，鉴定数能翻好几倍，很多低ng/mL级别的蛋白才开始冒出来。即便如此，离覆盖整个血浆蛋白质组还差得远。

所以"没检出"首先提示我们的就是：蛋白丰度可能确实低于现在实验条件下的有效检测范围。所以，我们如果换个前处理、分个馏、做个富集，结果就可能完全不同。

动态范围是我们硬件层面的限制，那另一个问题就可能出现在数据采集策略上。目前发现型蛋白质组学最常用的DDA模式，其实对低丰度肽段不友好。

DDA的工作流程：先做一次MS1全扫描，得到当前时刻所有洗脱肽段的质荷比和丰度；然后仪器自动挑选丰度最高的N个肽段（通常Top 10-20），逐个进行MS/MS碎裂。一个完整循环（1次MS1 + N次MS/MS）约1-3秒。

问题就出在"Top-N"上。如果同一洗脱窗口内有50个肽段共洗脱，仪器只选Top 15去碎裂，剩下的35个 —— 不管是否在检测限以上，都没有机会产生MS/MS谱图。没有MS/MS，就没有肽段鉴定，也就没有蛋白鉴定。

图2  DDA模式下的离子竞争与采样偏差。MS1中高丰度肽段（深蓝色）占据Top-N碎裂名额，低丰度肽段（灰色）即使高于检测限也可能被跳过，导致无MS/MS数据而漏检。

我常跟学生打比方：DDA就像记者会，在场50个记者举手，发言人每次只点前排声音最大的15个人提问。后排的记者不是不存在，是没被点到。连续开三场，每场被点到的人可能都不一样 —— 这就是DDA数据重现性差的根本原因，尤其是低丰度蛋白。

为避免同一个高丰度肽段被反复碎裂，DDA通常开启动态排除：一个肽段一旦被选中碎裂过，接下来30-60秒内不再被选中，把机会让给其他肽段。

这个设计初衷是好的，但对低丰度肽段有个坑：如果一个低丰度肽段在色谱峰上升段被选中一次，但信号太弱MS/MS质量太差搜不到库，然后它被动态排除了——等它到色谱峰顶点信号最强时，仪器反而不再选它。这种"该碎的时候没碎到，碎到的时候信号不够"的情况，在低丰度蛋白中非常常见。

这些年DIA越来越火，思路就是把完整的质荷比范围分成一个个小窗口，再把每个窗口里面的所有肽段全部碎裂，就不需要再做Top-N选择。这个操作，在理论上不会"漏掉"任何肽段。

不得不得承认DIA确实显著提升了检测的数据重现性和低丰度蛋白的定量能力。

但它也仍然不是万能的：

① 最后得到的MS/MS是多个肽段混合碎裂的结果，解析难度比较大，所以需要高质量谱图库；

② 共洗脱肽段间的离子抑制还是存在的，会导致信号弱的在混合谱图中被掩盖。

以我的经验来看，DIA比DDA多鉴定出的蛋白还是主要集中在中低丰度区间里，所以它对真正极低丰度的蛋白效果依然有限。

除了采样策略，还有一个物理层面的机制 —— 离子抑制。

先来回顾电喷雾电离（ESI）的原理：样品溶液在高压下形成带电液滴，液滴蒸发、分裂，最终释放气相离子进入质量分析器。但是液滴里面的电荷总量是有限的，所有溶解在里面的分子都要去竞争这些电荷和液滴表面位置。

所以说，在高丰度肽段和低丰度肽段一起洗脱的时候，高丰度分子就会占据绝大多数电荷和液滴表面的位置，导致低丰度分子的离子化效率被抑制。

总而言之：不是仪器灵敏度不够，是目标分子在离子化阶段就已经"输了"。

离子抑制在复杂基质中尤其严重。血浆、血清、细胞裂解液中大量高丰度蛋白肽段、盐类、脂质、去垢剂残留，都可能成为离子抑制来源。这也是色谱分离很重要的原因——把目标肽段和干扰分子在时间上分开，能有效缓解离子抑制。

分馏是提升低丰度蛋白鉴定深度最有效的手段之一，原理很简单：把复杂样本分成10个、20个甚至更多馏分，每个馏分的复杂度大大降低，离子抑制和DDA采样竞争都减轻了。

前面讲的是全蛋白质组分析中的普遍问题。现在聊一个IP-MS实验中特有的、很多人踩过却没意识到的坑——诱饵蛋白（bait）过表达反而导致互作蛋白漏检。

做IP-MS时，很多人（包括早年的我）本能地觉得：bait表达量越高，IP下来的蛋白越多，质谱信号越强，结果就越好。于是用强启动子、大剂量转染、不加限制地过表达bait。然后拿到结果一看：bait本身鉴定得非常好，覆盖率50%以上，但预期的互作蛋白要么没鉴定到，要么只有一两条肽段，定量也不稳定。

问题出在哪？

❶ bait自身肽段占满MS采样时间。

过表达的bait在IP洗脱物中占绝对主导，它的肽段可能有几十上百条，每条丰度都很高。DDA的Top-N采样名额大部分被bait肽段占据，低丰度的互作蛋白肽段根本排不上队。

❷ 离子抑制。

bait的高丰度肽段在ESI过程中压制共洗脱的互作蛋白肽段，后者即使被选中碎裂，MS/MS质量也可能很差。

❸ 非特异性结合增加。

bait过表达后，细胞内蛋白浓度远超生理水平，很多原本不结合的蛋白因为"浓度太高、碰得多了"产生弱的非特异性结合。这些蛋白也被IP下来，进一步增加样本复杂度，稀释真正互作蛋白的信号。更麻烦的是，过表达还可能改变细胞生理状态——蛋白定位异常、形成聚集体、诱导应激——导致互作组本身就不真实。

图3  IP-MS中诱饵蛋白过表达对互作蛋白的压制效应。左：生理表达水平下bait与prey比例适中，质谱可正常检测多种互作蛋白；右：bait过表达后其自身肽段占据MS采样名额和动态范围，互作蛋白信号被压制甚至漏检。

我之前做一个转录因子的互作组，学生一开始用CMV强启动子过表达FLAG-tagged bait，IP下来银染一看，bait那条带粗得快把凝胶染透了。送质谱回来，bait覆盖率65%，但只鉴定到不到30个互作蛋白，而且很多是常见污染蛋白（热休克蛋白、核糖体蛋白之类）。

我让他换成四环素诱导表达系统，把表达量调到接近内源水平（用Western和内源抗体比对），同时减少IP上样量。重做之后，bait覆盖率降到25%左右，但互作蛋白鉴定数翻了三倍多，而且很多是已知的和该转录因子功能相关的蛋白。这个教训我记到现在：

Proximity labeling（BioID/TurboID）实验中这个问题更突出。TurboID的bait会发生强烈的自生物素化（cis-biotinylation），bait自身的生物素化肽段在链霉亲和素富集后占绝对主导，大量消耗MS采样能力。有研究专门指出，TurboID bait的表达水平和最终鉴定到的近端蛋白数量之间存在显著相关性——表达过高时，假阴性和假阳性都会增加。

我的经验：

❶ 能用内源IP就用内源IP（ChIP-grade抗体或CRISPR敲入标签）；

❷ 必须过表达的话，用弱启动子或诱导系统，把表达量控制在接近内源水平；

❸ IP后跑SDS-PAGE看bait条带强度，如果银染或考染下bait条带占了绝大部分，说明上样量太多或表达太高，需要调整；

❹ 最后，用SILAC或TMT做定量，通过bait组vs对照组的富集倍数区分真阳性和背景，比单纯看有没有鉴定到可靠得多。

前面讲的是所有低丰度蛋白的共同问题。但有两类蛋白，除了丰度低之外，还有自身理化性质带来的额外困难——膜蛋白和分泌蛋白。这两类蛋白在生物学和药物研发中极其重要（膜蛋白占药物靶点的~60%），但在质谱数据中却经常"缺席"。

膜蛋白的质谱分析，从样本制备第一步就开始出问题。

膜蛋白嵌在磷脂双分子层中，跨膜结构域高度疏水。常规裂解液对膜蛋白溶解效率有限。需要用去垢剂增溶，但去垢剂会严重干扰电喷雾电离，所以通常需要反复清洗、沉淀、换缓冲液，每一步都在损失蛋白。

这是最关键的问题。跨膜区缺乏胰蛋白酶切位点（K/R），且疏水性强，导致产生的肽段过长、难电离、难洗脱，成为bottom-up蛋白质组学分析膜蛋白的主要瓶颈。

膜蛋白来源的肽段一般疏水性都比较强，在电喷雾中的离子化效率比亲水肽段低。而且这些肽段容易在色谱柱、进样针、管路表面吸附，进一步造成信号损失。

膜蛋白虽占人类基因组编码蛋白的约25%，但在细胞总蛋白质量中只占不到1%。大部分膜蛋白（尤其是GPCR、离子通道）的表达量都特别低，一个细胞可能就只有几百到几千个拷贝。

膜蛋白通常有复杂的糖基化修饰，也就是同一个蛋白的同一个糖基化位点上面可能连接着不同结构的糖链，导致信号被分散到多个峰上，所以每个峰的强度都不足以被检测到。

图4  膜蛋白质谱检测的多重难点。

这些因素叠加起来，结果就是：在常规全细胞裂解液的蛋白质组学项目里面，我们发现膜蛋白的序列的覆盖率一般只有5-15%，而且鉴定到的肽段几乎全部来自胞质侧或胞外侧的亲水环区，在跨膜结构域几乎就看不到了。

改善膜蛋白检测需要专门策略：先用蔗糖密度梯度离心或生物素化富集膜组分；用可降解去垢剂（如RapiGest）或FASP方法兼容酶切和质谱；考虑用LysC先切、再用胰蛋白酶切的双酶切策略，或用嗜热菌蛋白酶、Glu-C等其他蛋白酶补充跨膜区肽段；色谱上用更长梯度和更高有机相比例洗脱强疏水肽段。即便做了所有这些，膜蛋白覆盖率依然是蛋白质组学的"老大难"问题。

分泌蛋白的问题和膜蛋白有所不同，但同样棘手。

分泌蛋白研究通常用细胞培养上清作为样本。问题在于：为维持细胞存活，培养基中通常含10%胎牛血清（FBS），其中牛血清白蛋白浓度高达~5 g/L。而细胞分泌到培养基中的目标蛋白，浓度通常在ng/mL级别 —— 两者相差6个数量级。

这又是一个动态范围问题，而且比血浆更极端。牛白蛋白、牛IgG这些血清蛋白不仅占据质谱绝大部分信号，它们的肽段还会和细胞分泌蛋白的肽段共洗脱、竞争电荷。很多细胞分泌蛋白在这种背景下根本看不见。

一个常见的"解决办法"是换成无血清培养基。但这带来新问题：血清饥饿会诱导细胞应激反应，改变细胞分泌谱——你检测到的可能不是正常生理状态下的分泌蛋白，而是应激产物。而且很多细胞在无血清条件下状态差、甚至死亡，释放大量胞内蛋白，进一步污染分泌蛋白样本。

讲了这么多原因，最后落到实操上。当质谱结果里没有预期的蛋白时，根据我们的经验，建议按以下顺序排查。

用Western blot、ELISA或靶向质谱（PRM）在Input样本中验证目标蛋白的存在。如果Input里都检测不到，问题出在样本制备或生物系统本身，不是质谱的事。同时确认目标蛋白在你用的细胞系/组织/处理条件下确实表达（很多蛋白的表达有严格的组织特异性和条件依赖性），别假设它一定在。

在Human Protein Atlas、PaxDB等数据库中查一下目标蛋白的已知丰度。如果预期丰度在pg/mL级别，这时候需要考虑：分馏、富集、去高丰度蛋白、或者换靶向方法。

如果是IP-MS实验，检查bait的表达量和IP上样量。bait是不是过表达了？银染/考染下bait条带是不是占了绝大部分？如果是，降低表达量或减少上样量重做。如果是膜蛋白，检查前处理是否用了合适的去垢剂和酶切方案。如果是分泌蛋白，检查培养基中的血清背景。

如果已经做了所有能做的优化，发现型质谱仍然检测不到目标蛋白，但Western或ELISA提示它存在，那么用PRM（平行反应监测）或SRM做靶向验证。靶向方法比DDA灵敏5-10倍，而且不受Top-N采样偏差影响。很多DDA检测不到的低丰度蛋白，用PRM都能测到。

最后要有清醒认识：质谱不是万能的。如果一个蛋白的丰度实在太低，而且无法通过富集或分馏提升，那么基于抗体的超高灵敏检测方法可能比质谱更合适。做科研不是非要用质谱，选对工具比硬撑重要。

回到开头学生的那个问题。我让他回去做Input的Western，同时查了一下那个互作蛋白的已知丰度——是一个低丰度的转录共激活因子。我建议他把IP产物分两个馏分跑，同时用DIA代替DDA。两周后他回来，那个蛋白鉴定到了，3条唯一肽段，定量还挺稳定。

所以总结为一句话：质谱"没检出"是一个技术结论，在把"absence of detection"等同于"absence of protein"之前，先想想你的实验条件有没有给那个蛋白一个被看到的机会。

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