中药单体与复方的机制研究：基于质谱的蛋白质组学实验思路差异

图1　单体与复方的蛋白质组学研究路线对比

单体研究要求确定分子直接结合的蛋白，并提供物理互作证据；仅依据表达量变化不足以确立机制。技术上分为带探针的化学标记，和不动分子的无标记生物物理两类。

化学蛋白质组学的做法，是把分子改造为可富集的探针：一端接共价捕获基团，一端接报告基团（生物素或点击化学用的炔基）。关键设计要点如下。

氟磷酸酯（FP）与丝氨酸水解酶活性中心的亲核残基共价反应，配 TMT 或无标记定量可一次覆盖复杂样本中的酶活；硫氟交换（SuFEx）可共价修饰 Tyr、His、Thr，扩大天然产物的靶点覆盖。

常用双吖丙啶、二苯甲酮、芳基叠氮。双吖丙啶基团小、对骨架扰动低，光解生成的卡宾中间体与邻近氨基酸形成共价键；需注意烷基双吖丙啶光解易生成重氮中间体，对谷氨酸、天冬氨酸等酸性残基及膜蛋白表面有偏好，研究跨膜受体时这一偏好反而有利。

化学探针的主要误差来源是非特异结合。初次实验常富集到大量假阳性蛋白，多来自链霉亲和素磁珠。

控制方法有三条：

❶ 竞争实验：用过量未标记原药与探针竞争结合位点，探针富集信号显著下降的蛋白才判定为高置信靶点；

❷ 加强洗涤：可用 1% SDS、8 M 尿素、1 M NaCl 处理链霉亲和素磁珠；

❸ 背景扣除：建立自有背景库（对标人类 CRAPome），剔除反复出现的非特异蛋白。

探针衍生物先在细胞中验证活性。修饰后若分子丧失药效，其富集信号再强也不可靠。

图2　化学蛋白质组学探针结构与背景控制要点

许多萜类、黄酮经化学修饰后易失活，探针合成门槛也高。无标记方法不改造分子，利用配体结合改变靶蛋白热稳定性或抗水解能力的原理进行筛选。五类常用手段对比如下。

将样品在 37–67 ℃ 梯度加热，取可溶性蛋白定量、拟合熔解曲线，靶蛋白 Tm 随配体结合漂移；固定温度、变化合物浓度的 TPP-CCR 可获得剂量-效应曲线，并估算表观解离常数 Kd。

数据处理有几个容易被忽视的要点：

传统 TPP 每个温度点单独上机，通量受限；PISA 将各温度上清按比例混合为单一样本，通量提升 10–100 倍，可在有限机时内同时筛选数十个单体或浓度梯度。

代表性结果包括土木香内酯的直接靶 AKR1C1、兰索拉唑对细胞色素 bc1 复合物的作用；向裂解液补充 ATP 或 RNA，还可捕获依赖辅因子的大复合物互作。

其余方法中，LiP-MS 可在配体结合位点附近检测到受空间保护的肽段，给出结合域位置；TD-SPROX 可对带翻译后修饰的完整蛋白形态分别评估折叠稳定性。

图3　TPP 熔解曲线漂移（左）与 PISA 高通量原理（右）

通过TPP、PISA 鉴定到的热稳定蛋白中，仍然存在上游信号传导或复合物重排导致的间接稳定蛋白。引入AI进行结构计算可助力缩小候选范围，但不能直接作为结论。

以 AlphaFold3 为代表的模型能预测蛋白-配体静态互作及氨基酸侧链取向，并与热位移分析完成的初筛形成闭环。

● 代表性流程：热位移高通量初筛给出候选集，AI 模型做高置信构象打分，再回到生化验证；

实例：去甲泽拉木醛（Demethylzeylasteral）以 MAPS-iTSA 热蛋白质组联合结构感知图神经网络 HoloGNN，锁定直接靶标 ACLY，后续确证其通过 ACLY 逆转银屑病模型的脂质代谢重编程；

● 基于细胞化学蛋白质组预训练的模型（如 C-PLANK），对胞内真实互作的预测更准。

仅依赖AI 打分不足以支撑结合，在进行生化验证前，都不建议直接下结论。

复方提取物成分复杂、极性差异可达数个数量级，丰度悬殊。若用上述的探针或热稳定性方法直接筛选“全部靶点”，非特异背景会严重干扰信号。正确路径是先测量整体系统响应，再结合网络药理学反推机制与配伍。

 最新一代达 35 通道，可在单批次内同时纳入对照、模型、复方低/中/高剂量及拆方组；传统 TMT 存在定量比值压缩（共流出肽段压低真实倍数）的问题，基于实时搜索的 SPS MS3 可剔除干扰离子，提高小倍数变化的定量精度。

不局限于高丰度母离子，在低丰度蛋白检出、定量连续性与大队列完整性上显著优于 DDA。硬件方面：Orbitrap Astral 以 200 Hz 扫描速率支持 0.6 Th 窄窗口 DIA，并兼容 18-plex TMTpro，半小时可定量上万个蛋白；timsTOF dia-PASEF 引入捕集离子淌度，按碰撞截面积 CCS 再分一维，降低同分异构肽与高杂样本的谱图重叠。

网络药理学用 TCMSP、ADME 参数正向预测活性成分与靶点，构建“成分-靶点-疾病”网络。但纯算法预测假阳性较多，且缺乏真实生理反馈，需用实验差异蛋白加以收敛：

图4　复方研究中预测、实验与验证的整合闭环

多靶点效应还体现在作用的空间分布上。

许多成分存在毒理性偏好，如雷公藤多苷的肝肾毒性主要源于线粒体功能障碍。全细胞匀浆的常见问题是高丰度胞浆与骨架蛋白掩盖微量的细胞器膜蛋白，经差速离心或亲和纯化分离线粒体、溶酶体、细胞核后分别进行质谱分析，即可暴露这些变化。

治疗肿瘤与免疫疾病时，复方通过对肿瘤微环境进行系统性重塑发挥疗效。通过激光捕获显微切割（LCM）与微量蛋白质组平台，即可对给药前后：肿瘤实质与间质浸润区免疫细胞组成进行原位比较。如比较耗竭型 CD8+ T 细胞的复苏、M2 型巨噬细胞极化，以及肿瘤-免疫细胞空间邻近度的变化。

无论单体还是复方，质谱给出的都是线索，必须靠靶向验证排除假阳性、确立因果。我审稿时常见的问题，是跳过验证就直接下机制结论。

以重同位素 AQUA 肽为内标，一针 LC-MS/MS 可同时对上百个关键蛋白做高精度绝对定量，突破抗体依赖性 Western Blot 的通量限制；

机制涉及蛋白互作改变时，用特异性抗体富集并结合 CRAPome 背景扣除，分析靶蛋白结合配体群的变化；

磷酸化、泛素化是信号传导的快速环节，部分单体在不改变总蛋白量的情况下重塑激酶组图谱；现有平台半小时可覆盖上万磷酸化位点，适合急性缺血、炎症风暴等短时间窗研究。

前述判断最终要落到标准化的样本分组与分析模块上。以“谱度众合中药靶点及作用机制研究一站式方案”为例，该技术路线覆盖了本文讨论的关键环节：

❶ 入血/入组织成分分析：系统鉴定真正吸收入血或进入靶组织的化合物，作为“由方到单”的入口；

❷ 直接靶点筛选：非变性条件下处理药物组与溶剂对照，用 LiP-MS 或 TPP，以肽段/蛋白丰度或热稳定性差异锁定直接结合靶点；

❸ 疾病与治疗靶点：设对照、疾病模型、给药三组，分别比较“疾病组 vs 对照”和“给药组 vs 模型组”，以火山图、热图、GO/KEGG/GSEA 呈现；

❹ 网络与对接：用 TCMSP、BATMAN-TCM、SwissTargetPrediction 预测靶点并与实验差异蛋白取交集，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络；对核心靶点与关键成分做分子对接，以结合能（通常 < -5 kcal/mol）评估结合强度并可视化结合模式。

单体与复方代表了蛋白质组学机制研究的两个方向：前者追求直接物理结合的明确证据，后者刻画多成分对系统网络的整体扰动。实际工作中二者并不割裂，较稳妥的路径是“由方到单、由单释方”——先以高深度定量蛋白质组刻画复方的整体响应，再对入血活性单体做直接靶点验证。方法选择应服从研究对象的物质基础，而不是反过来。

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参考资料