中药作用机制研究中的无标记质谱技术 | LiP-MS vs. TPP怎么选？

中药及天然产物具有多成分、多靶点、作用网络复杂等特点。对于中药活性单体、提取物或复杂天然产物体系，研究者真正想回答的问题通常是：

1. 化合物进入细胞后，直接结合了哪些蛋白？

2. 哪些蛋白是真正的作用靶点？

3. 是否存在未知靶点？

4. 化合物结合后改变了蛋白结构还是稳定性？

5. 这些结合事件如何解释后续药理效应？

近年来，以质谱为核心的无标记靶点筛选技术逐渐成为药物机制研究的重要工具，其中热蛋白质组学（TPP） 和有限蛋白质谱（LiP-MS）成为天然产物和中药活性成分靶点发现的重要策略。因此很多研究者会纠结：“我的中药单体应该做 TPP 还是 LiP-MS？”

两者虽然都属于无标记靶点筛选技术，但检测逻辑完全不同。今天我们就来给大家梳理一下，在中药作用机制研究中，这两项技术应该如何选择？

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两种无标记技术的核心差异，源于它们捕捉的配体结合效应完全不同：TPP站在整体热力学视角，观测蛋白受热变性的稳定性变化；LiP-MS站在局部结构视角，观测蛋白表面酶切敏感性的改变。

小分子与靶蛋白结合后会让蛋白更耐热、熔解温度升高，TPP技术就是通过在全蛋白组范围内检测这种热稳定性变化来推断药物的作用靶点。

❶ 样本孵育：将活细胞、组织匀浆或非变性裂解液分为药物组与对照组，充分孵育使结合达到平衡；

❷ 梯度加热：样本分装后置于37–67℃的温度梯度中短暂加热，随后迅速冷却终止热应激；

❸ 分离可溶蛋白：超速离心去除变性聚集的沉淀，保留上清中仍保持天然折叠的可溶性蛋白；

❹ 质谱分析：蛋白经酶解、多重标记后通过LC-MS/MS定量，拟合蛋白熔解曲线，计算Tm值变化（ΔTm），筛选稳定性显著改变的蛋白。

除经典模式外，TPP还有浓度梯度TPP、高通量PISA等变体，可适配不同筛选场景。

LiP-MS不依赖蛋白热稳定性，它利用药物结合会改变蛋白结构、影响蛋白酶切割效率的特性，通过对比两组肽段丰度差异来定位发生构象改变的蛋白及具体区域。

❶ 天然蛋白提取：在非变性缓冲液中提取蛋白，避免强变性剂破坏蛋白天然构象；

❷ 药物孵育：分组加入化合物孵育，使结合达到平衡；

❸ 限制性酶解：按精确的酶-底物比例加入蛋白酶K，常温下进行短时间脉冲酶解，随后立即淬灭反应；

❹ 检测与分析：变性后用胰酶彻底二次酶解，经LC-MS/MS检测，筛选丰度显著变化的“结构敏感肽段”，锁定靶蛋白与构象变化区域。

LiP-MS可达到肽段级分辨率，不仅能确认结合蛋白，还能大致定位结合区域。

两种技术都能在无需修饰化合物的前提下，实现全蛋白组范围内的未知靶点发现，这也是它们成为中药研究核心工具的基础。但两者的信号来源与盲区截然不同：

当化合物结合激酶、代谢酶等靶点后，使蛋白折叠更加致密、整体热力学稳定性大幅提升时，Tm值会出现明显升高，此时TPP的信号清晰、统计稳健，优势十分明显。

● 情况2：结合仅引发局部构象变化，整体稳定性改变微弱

很多中药成分结合在蛋白表面的柔性区域，或通过弱别构效应发挥作用，结合事件不足以改变蛋白整体的耐热能力，此时TPP极易出现假阴性。而LiP-MS专注于局部酶切敏感性的变化，哪怕只有微小的构象调整也能被捕捉，对这类结合事件的灵敏度远高于TPP。

TPP的读出是蛋白水平的整体稳定性变化，它只能告诉你“这个蛋白可能结合了”，但无法提供结合在哪个结构域、哪个氨基酸区域的信息。

LiP-MS的读出单元是肽段，分辨率可达十几个氨基酸水平。差异肽段的位置可以直接映射到蛋白三维结构上，大致锁定结合口袋或别构区域，甚至可以区分正构结合与别构调节，为后续分子对接、定点突变实验提供精确的坐标指引。

● TPP的经典流程可在活细胞内完成，它完整保留了细胞的区室化结构、内源性代谢环境与信号网络，不仅能检测直接结合，还能捕捉下游信号级联引发的间接稳定性变化，非常适合观测中药对整个通路网络的扰动。

● 传统LiP-MS主要在细胞裂解液中进行，裂解过程破坏了细胞结构与脆弱的蛋白互作，因此主要反映药物与蛋白的直接物理接触。

膜蛋白（如GPCR、离子通道）是中药极为重要的潜在靶点池，但也是两类技术共同的难点。

● TPP中，膜蛋白本身难溶解，加热后更易发生非特异性聚集，即便加入去垢剂增溶，多数去垢剂在50℃以上会发生浊点相变，反而引入严重的背景噪音，导致膜蛋白覆盖度极低。

● LiP-MS在常温下进行酶解，避开了热诱导聚集与去垢剂高温相变的陷阱，结合温和的非变性增溶体系，对膜蛋白胞内外柔性区域的检出稳定性优于TPP。

推荐：首选活细胞TPP

如果你已经确认某一天然单体（如黄酮、生物碱、萜类）具有明确的细胞活性，但完全不知道作用靶点，优先选择TPP。

● 技术成熟度高，文献积累丰富，分析流程标准化，新手更容易上手；

● 可以直接在活细胞环境中检测，保留药物的原位代谢激活（如苷类成分的水解脱糖）与亚细胞分布，结果更贴近生理真实；

● 不需要对天然产物进行任何结构改造，避免破坏其活性。

青蒿素、黄芩苷、丹参酮、雷公藤内酯等经典天然产物的靶点发现，均有大量TPP技术的成功应用案例。如果研究对象是复杂提取物，可进一步选择PISA变体，以更高通量完成初筛。

推荐：LiP-MS

很多中药成分细胞表型显著，但TPP反复筛选却得不到稳定靶点，这并不意味着“没有靶点”，很可能是结合方式不在TPP的检测范围内：

中药黄酮、多酚、皂苷等成分亲和力普遍较弱，常处于微摩尔级别，不足以引发可检测的Tm值偏移；

部分成分仅结合蛋白表面柔性区域，或通过别构效应微调蛋白功能，不改变整体折叠稳定性。

此时切换到LiP-MS，往往能挖掘出TPP遗漏的靶点。LiP-MS对数百μM级别的弱相互作用仍有很高的置信度，非常契合中药成分“温和、微调”的作用特点。

推荐：LiP-MS

如果已经通过网络药理学、TPP初筛或文献锁定了候选靶点，下一步想明确结合结构域、关键氨基酸，为分子对接、点突变、SPR/MST验证提供线索，LiP-MS是不二之选。

通过差异敏感肽段在蛋白序列上的定位，可以大致圈定结合口袋或别构位点，判断化合物是竞争性占据活性中心，还是通过别构效应调控蛋白功能。这种结构层面的信息，是TPP完全无法提供的。

推荐：优先TPP（PISA/iTSA）

对于丹参提取物、人参皂苷组合物甚至中药复方，多成分同时作用于多个蛋白，信号体系极为复杂。此时TPP的实施门槛更低，分析流程更成熟。

尤其是PISA技术，通过合并温度梯度样本大幅压缩检测通量，可在一个TMT批次内同时对比全方、君药组分、多个单体的靶向图谱，以极高的性价比绘制“多成分-多靶点”互作网络，非常适合中药复方的系统研究。

推荐：TPP

中药的疗效往往源于对整个信号网络的调控，而非单一靶点的抑制。TPP不仅能检测直接结合的靶蛋白，还能捕捉到“连坐效应”：靶蛋白被抑制后，下游底物的磷酸化状态改变、蛋白复合物发生组装或解聚，都会引发热稳定性的同步偏移。

通过分析这些协同变化的蛋白集群，可以快速勾勒出药物扰动的完整通路图谱，更契合中医药整体调控的研究视角。

对于高价值的中药活性分子研究，单一技术必然存在盲区，最优解从来不是二选一，而是TPP与LiP-MS正交联合，构建从“筛选”到“解析”的完整证据链。

两者提供的信息高度互补：

● TPP：在真实生理环境中告诉你“谁可能结合”，同时呈现下游通路与复合物的整体扰动，快速锚定研究方向；

● LiP-MS：在结构层面告诉你“结合在哪里发生”，提供精确的位点信息，支撑深入的机制解析。

推荐完整研究路线

活性评价 → 活细胞TPP（或PISA）初筛候选靶点 → LiP-MS验证并解析结合区域 → 分子模拟对接 → 定点突变/SPR生物物理验证 → 细胞与动物功能验证

总而言之，TPP 与 LiP-MS 各有侧重，前者适合快速锁定候选靶点与通路，后者精于定位结合区域与解析机制。中药靶点机制研究需多技术交叉印证，才能构建完整的科学证据链。

若想高效落地这套研究思路，谱度众合推出的中药靶点及作用机制研究一站式解决方案是成熟选择：方案支持LiP-MS/TPP靶点筛选自选，配套成分鉴定、网络构建、通路富集、分子对接等全流程分析，交付报告可覆盖中科院二区期刊九成核心工作量，收样后1个月即可出结果，助力课题高效推进。

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参考资料