天然产物靶点鉴定与基于单靶点设计的合成药物不同，中药活性分子往往骨架复杂、官能团丰富。它们通常以多靶点、弱亲和力的模式起效，这让其作用机制长期处于“黑匣子”状态。

随着化学蛋白质组学与高通量质谱技术的深度融合，中药靶点筛选已经形成了标记法与非标记法两大成熟技术体系。但在具体的课题设计阶段，大家常常陷入纠结：到底该选哪种技术？为什么大家都觉得呼声很高的“非标记法”比传统的“标记法”更好？

今天这篇文章，我们就来快速梳理这两大技术体系的核心逻辑，并重点拆解四类典型科研场景的最优落地策略，帮大家在实验设计阶段理清思路，少走弯路。

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靶点筛选技术的核心分野，在于是否需要对天然活性分子进行化学结构修饰。为了方便大家快速判断，我们对两者的核心差异进行了提炼：

这是“主动改造、钓鱼取证”的过程。通过有机合成手段引入特定的追踪或富集基团，将天然分子改造为功能化分子探针。

包括经典的生物素-链霉亲和素Pull-down、保护天然构象的Strep-tag技术，以及兼容活细胞内瞬态相互作用的光亲和标记（PAL）联合点击化学。

能拿到直接结合的“硬核”证据，有效过滤下游信号通路带来的背景噪音。

入场门槛高，高度依赖已知的构效关系。化学合成成本高，且无法应用于天然丰度极低的珍稀成分。

这是“原位观测、逆向推导”的过程。完全不对化合物进行化学修饰，而是基于配体结合会改变蛋白特定理化性质（如热力学稳定性、抗水解能力）的定律，反向推导靶蛋白。

分为基于水解稳定性的技术（如DARTS、结构分辨率极高的LiP-MS）和基于热稳定性的技术（如细胞热位移分析CETSA、全蛋白质组扩展版TPP、以及效率极高的PISA）。

适用范围极广，完美保留化合物天然活性。能兼容微量成分甚至中药复方，生理相关性强，样本消耗极低。

属于间接推断，容易受到蛋白翻译后修饰或下游信号通路的干扰而产生假阳性，且对后期数据解读、统计算法要求较高。

为了方便大家对比，丸子给大家整理了表格：

那么，非标记法一定比标记法好吗？

显然不是。技术本身没有绝对的优劣，关键在于匹配课题阶段与研究目标。

标记法与非标记法从来不是二选一的对立关系，而是构成了从假设生成到严谨确证的完整闭环。为了让大家能直接落地执行，我们针对中药及天然产物研究中最常见的四类场景，匹配了最优实验策略：

样品极为珍贵（如罕见微生物次级代谢产物），且完全不清楚构效关系。贸然进行探针合成，极易导致活性丧失或靶点漂移，前期投入打水漂。

TPP-PISA高通量初筛+DARTS/CETSA正交验证。

❶ 首先利用PISA技术进行全蛋白质组初筛。PISA通过合并不同温度点的样本，能把传统TPP的10次质谱进样压缩为1次，大幅节省样本，非常适合稀缺样品的“盲盒式”扫描。

❷ 锁定排名靠前的候选蛋白后，使用门槛低、操作简便的DARTS技术在体外进行正交验证。只需将化合物与细胞裂解液孵育，加入蛋白酶进行可控酶解，通过免疫印迹观察降解差异即可初步确认结合。

对于新骨架成分，切忌一上来就砸钱做探针合成。利用非标记方法以低成本、低消耗完成靶点发现到验证的闭环，才是性价比之选。

研究全合成/半合成工艺成熟、药效明确的中药单体，课题已进入深度机制解析阶段。为了冲击高质量期刊，不仅需要活细胞内直接结合的“实锤”，还要精确解析结合区域与别构调控机制。

双功能光亲和探针（PAL）+LiP-MS三维映射。

❶ 第一步，基于清晰的构效关系，在不影响活性的位点合成双功能光亲和探针，并在活细胞内完成靶蛋白交联与富集。这能为你提供顶级期刊高度认可的活细胞内直接结合证据，排除了间接作用干扰。

❷ 第二步，锁定靶点后，应用LiP-MS技术进行精细结构解析。对比给药组与对照组的半胰酶切肽段丰度差异，精准定位药物结合保护肽段与别构效应区域，为分子级别的结构改造提供导航。

前提是一定要选对修饰位点。若对活性位点判断不准，务必先做简单的基团修饰预实验来验证活性。

研究对象是复方、粗提物或多靶点活性成分，单一靶点无法解释整体药效，同时需要筛查潜在肝肾毒性相关的脱靶蛋白。此时标记法完全无法适用。

活细胞模型中的高分辨TPP组学。

在生理相关的活细胞系中开展TPP实验（结合TMT同位素定量标记）。这种全局视角不仅能捕捉直接结合靶标，还能观测到药物进入细胞后引发的下游通路激活等“波纹效应”。它完兼容复杂混合物体系，能够完整呈现多靶点协同作用的网络，并系统筛查脱靶毒性蛋白。

TPP给出的是全局状态变化，必须注意区分直接靶点与间接效应，后续挑选核心节点蛋白需进行正交实验验证。

已经通过网络药理学或分子对接获得了预测靶点，急需高效的生化/细胞实验排除假阳性，为文章补充说服力强的实验证据。

等温剂量反应指纹图谱（ITDRF-CETSA）或NanoBRET实时监测。

普适性最强的是ITDRF-CETSA。在特定温度下，通过WesternBlot定量检测上清中可溶性靶蛋白随药物浓度梯度的变化，如果发生梯度回升，便是靶标啮合的经典判据。该方法仅需常规分子生物学设备即可开展。若预算充足且追求高通量与动力学数据，可构建NanoBRET探针体系，在活细胞内实时定量监测。

千万不要把分子对接结果直接作为最终结论，补上细胞水平的结合验证，文章的严谨性将得到质的飞跃。

非标记技术打破了化学合成的门槛，让结构复杂、易失活的天然产物第一次能够在活细胞、全蛋白质组尺度上展现真实的作用图谱；而标记技术则始终是过滤生物学噪音、提供物理结合“硬证据”的坚实底座。

做中药靶点研究，单一维度的证据永远是脆弱的。只有多维度、跨尺度的证据链深度融合，我们才能真正揭开中药作用机制的黑匣子，推动中药原始创新走向现代临床。

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