❶ RNA/DNA Pull-down能够告诉我们“哪些蛋白能够结合核酸”；

❷ B-isox富集能够告诉我们“哪些蛋白具有形成凝聚体的结构特征”；

❸ LLPS数据库可以回答“哪些蛋白已经被证明发生相分离”；

❹ 生物信息学预测则能够进一步评估蛋白是否具有天然无序区（IDR）或低复杂度结构域（LCD）。

因此，将这些证据整合起来，可以构建一套更加可靠的筛选策略。

整个流程可以概括为五个层级：实验筛选 → 数据整合 → 生信预测 → 功能验证

Figure1. 技术路线图

RNA/DNA Pull-down联合质谱分析，是筛选核酸结合蛋白最成熟的方法之一。

实验的核心思想非常简单：利用生物素标记的RNA或DNA探针，从细胞裂解液中“钓取”能够结合目标核酸的蛋白，随后通过LC-MS/MS进行鉴定。

这一策略能够获得一个较大的候选蛋白集合，其中通常包括：

需要特别强调的是：

Pull-down实验获得的是“核酸相关蛋白（NA-associated proteins）”，并不意味着所有蛋白都直接与RNA或DNA发生结合。

因此，它更适合作为第一轮广泛筛选。

如果说Pull-down回答的是“谁能结合核酸”，那么B-isox回答的则是：谁具有形成生物分子凝聚体的结构基础？

B-isox（Biotinylated isoxazole）能够选择性沉淀富含低复杂度结构域（LCD）的蛋白，而这类蛋白恰恰是LLPS研究中的主角。

经典的相分离蛋白，如FUS、hnRNPA1、TDP-43、NONO、SFPQ和多个DDX家族成员，都能够被B-isox有效富集。

不过需要认识到，B-isox富集的是“低复杂度蛋白网络”，而不是“所有能够发生LLPS的蛋白”。

因此：

它本质上是一种提高筛选效率的富集工具。

真正值得关注的蛋白，往往来自两套实验数据的交集。

换句话说，我们希望找到那些既能够结合RNA/DNA，又具有形成凝聚体潜能的蛋白。

这一交集能够有效过滤掉：

相比单独分析Pull-down数据，这一步通常可以将候选蛋白数量缩小至几十到一两百个，更适合开展后续机制研究。

实验数据只是起点，公开数据库则提供了另一种重要证据。

对于交集蛋白，可以进一步检索多个LLPS数据库，例如：LLPSDB / PhaSePro / DrLLPS

重点关注以下几个问题：

1. 是否已有LLPS报道？

2. 是否已经观察到液滴形成？

3. 是否具有FRAP恢复？

4. 是否依赖RNA促进相分离？

5. 是否参与核仁、Stress Granule或P-body等凝聚体？

如果某个蛋白已经在多个数据库中出现，那么其作为LLPS蛋白的可信度将显著提高；反之，如果尚无报道，则可能意味着具有较高的新颖性。

绝大多数经典LLPS蛋白都具有共同的结构特征：

因此，生物信息学预测是整个筛选流程的重要组成部分。

推荐使用以下工具：

如果一个候选蛋白同时具有明显IDR、LCD，并预测具有较高LLPS倾向，那么其进入后续验证阶段的优先级应进一步提高。

Pull-down实验能够提供实验层面的证据，但仍无法完全区分直接结合与间接结合。

因此，可以进一步结合RNA结合数据库进行注释，

例如：RBPbase / EuRBPDB / RNAInter / ENCODE eCLIP数据

重点关注：

1. 是否具有RNA结合结构域（RRM、KH、ZnF等）；

2. 是否已有CLIP-seq或eCLIP证据；

3. 是否已有RNA结合位点报道；

4. 是否属于经典RNA结合蛋白家族。

这一步能够进一步增强候选蛋白的可靠性。

所有筛选策略最终都需要回归实验。

推荐按照由易到难的顺序开展验证：

❶ 细胞定位：观察蛋白是否形成离散颗粒或凝聚体；

❷ FRAP：检测凝聚体是否具有动态恢复能力；

❸ 1,6-Hexanediol处理：评估凝聚体是否依赖弱相互作用维持；

❹ 体外Droplet Assay：验证纯化蛋白是否能够自主形成液滴，以及RNA/DNA是否促进或抑制液滴形成；

❺ 结构域缺失或点突变：删除IDR/LCD或破坏关键相互作用位点，验证相分离能力是否受到影响。

只有当功能实验与前期筛选结果相互印证时，才能较为可靠地证明一个蛋白是真正意义上的核酸结合相分离蛋白。

RNA/DNA Pull-down、B-isox富集、LLPS数据库、生物信息学预测和RNA结合数据库，各自回答的是不同层面的科学问题。真正有价值的研究，不在于依赖某一种技术，而在于将这些互补的信息整合成一套逻辑严密、层层递进的筛选框架。

对于希望探索RNA或DNA调控相分离机制的研究者而言，这种“实验 + 数据库 + 生信 + 功能验证”的多维策略，不仅能够显著提高候选蛋白筛选的准确性，还能够帮助发现那些尚未被报道的新型LLPS分子，为后续机制研究和疾病相关研究提供坚实的基础。