药物靶点发掘综述|化学蛋白质组学技术盘点

化学蛋白质组学是蛋白质组学的一个重要分支，它综合了药物化学、细胞生物学和蛋白质组学等多种研究方法，是目前系统鉴定活性小分子蛋白靶点的核心技术。该领域利用能与蛋白质发生特异性相互作用的化学小分子来干扰和探测蛋白质组，在全蛋白质组水平系统分析小分子-蛋白质相互作用，进而揭示小分子在生理、病理以及药理过程中发挥的功能。随着化学生物学和蛋白质组学技术的发展，化学蛋白质组学方法已成为创新药物研发中活性小分子靶标鉴定的主流技术。

化学蛋白质组学技术可以分为两大类：一类是化学衍生化方法，它基于化合物分子和靶蛋白的亲和性或者反应性，在复杂蛋白质组背景下特异性抓取靶蛋白。这类方法需要对配体化合物进行结构改造，将其固定在载体上或者添加可用于富集的标签，通过共价结合或特异性相互作用筛选鉴定靶蛋白。另一类是非衍生化方法，它基于配体结合靶蛋白后引起的靶蛋白理化性质改变来鉴定靶标，无需对化合物进行修饰，检测的性质包括蛋白质稳定性、构象变化、翻译后修饰等。

Figure 1 化学蛋白质组学技术分类[1] 

顾名思义，这类方法不需要对配体分子进行化学修饰，目前已经发展出多种无需化学修饰便能直接对药物靶蛋白进行全组学鉴定的技术，包括蛋白有限水解质谱（Limited Proteolysis-Mass Spectrometry，LiP-MS）、热蛋白质组分析技术(Thermal proteome profiling，TPP)、蛋白质氧化速率稳定性技术(Stability of proteins from rates of oxidation，SPROX)等。这些方法的共同特点是：配体结合会改变蛋白质在生物体内的动态平衡，利用配体诱导的蛋白质稳定性增强（包括抗蛋白酶解稳定性、抗氧化稳定性以及抗热处理稳定性），来鉴定配体分子的靶蛋白。

TPP技术是在CETSA方法基础上发展而来的组学技术，二者原理相似。CETSA是一种直接检测细胞内药物与靶蛋白结合效率的实验方法，其核心原理是：靶蛋白与药物分子结合后通常会变得更加稳定。随着温度升高，游离蛋白会逐渐发生变性沉淀；当蛋白结合药物后，相同温度下未降解的可溶性蛋白比例会提高，该复合蛋白的热熔曲线会向右移动。

Figure 2 TPP实验流程^[2]

类似的，LiP-MS技术可以看作是DARTS方法的技术升级版。DARTS的核心策略是：将小分子药物与样品蛋白共孵育后，加入蛋白酶进行消化；由于小分子药物结合靶蛋白后可以在整体上稳定蛋白，使其对蛋白酶水解的敏感性降低，通过对比不加药物的消化组，找出受保护的蛋白条带，再通过质谱技术即可鉴定出潜在的药物靶标蛋白。

Limited Proteolysis（LiP-MS）则是基于小分子结合蛋白后引起局部的蛋白稳定性或者构象变化从而形成不同的酶切位点，通过质谱检测这种酶切图谱的差异来推测小分子结合位点。实验流程为：先使用低浓度的非选择性蛋白酶K进行有限水解，蛋白酶会优先切割蛋白质表面暴露的柔性区域（无规卷曲或未折叠部分）；然后经过变性和胰蛋白酶二次消化，通过液相色谱-质谱（LC-MS）分析肽段混合物。药物处理细胞后，药物的靶标蛋白由于小分子结合发生构象改变，从而避免了被蛋白酶K切割，半酶切肽段的丰度会出现显著减少，这种变化即可作为小分子结合的判断依据。

Figure 3 LiP-MS实验分析流程[3]

SPROX同样利用配体诱导蛋白质稳定性增强的原理建立方法。该技术通过测定靶蛋白中甲硫氨酸(Met)的氧化水平，利用配体诱导的蛋白质热力学变化来鉴定靶标。其主要策略为：首先将蛋白质样品与药物或对照溶剂共孵育，在浓度梯度递增的化学变性剂（如盐酸胍）存在下，加入氧化剂（如过氧化氢）氧化甲硫氨酸形成甲硫氨酸亚砜(Met-O)或甲硫氨酸砜(Met-O₂)，随后淬灭氧化反应，胰酶消化成肽段后进行LC-MS/MS定量分析；以未氧化和氧化的含Met肽段的量为纵坐标，变性剂浓度为横坐标作图，药物结合蛋白后，未氧化/氧化肽段的转变中点会向右移动，说明稳定性提高。

Figure 4 SPROX实验流程^[4]

TRAP是近期发表的一项新技术，它的主要原理是，配体与靶蛋白结合后，由于空间位阻或变构效应，导致靶蛋白对应区域的活性赖氨酸残基无法被共价标记。在此基础上，利用同位素甲醛(CD2O)和硼烷-吡啶络合物(BPC)进行标记，使赖氨酸残基发生+32.06 Da的质量偏移（避免内源性赖氨酸二甲基化的干扰）。然后，通过比较有无配体孵育组别中含赖氨酸肽的定量比值(R_{treated/control})，将在R_{treated/control}中表现出显著变化的肽指定为互作肽段，并同时将应答蛋白指定为靶标蛋白。

Figure 5 TRAP方法流程^[5]

衍生化的化学蛋白质组学技术利用化学分子探针研究活性药物、活性蛋白及其作用靶点，其中分子探针可以是已知功能药物（或代谢物）分子的化学衍生（根据化合物结构添加标签），也可以是未知功能的含有标签的化合物分子（用于功能筛选）。

衍生化化学蛋白质组学中最经典的技术就是ABPP。ABPP方法的核心是设计能够在蛋白质组内与某一类蛋白酶活性中心氨基酸残基发生共价反应的活性分子探针(Activity-based Probe, ABP)。由于ABP对蛋白的化学修饰发生在决定其生物活性的催化中心，因此我们可以通过该探针标记水平的高低，在复杂蛋白质组背景下直接读取这类蛋白酶的活性功能状态。

ABP的设计通常包含两个基本组成部分：反应基团和报告基团，一般通过碳链或者聚乙二醇链将二者连接在一起：

➢反应基团：通常是具有独特化学结构的亲电性小分子，能够选择性地与蛋白质组中某一类蛋白活性中心的亲核氨基酸发生反应，从而将探针分子共价标记在靶蛋白上。

➢报告基团：作用是精确反映反应基团对靶蛋白的标记水平，并可以将被探针标记的靶蛋白选择性富集出来，通常分为荧光基团和富集基团（如生物素）。

对于那些通过非共价方式与蛋白质发生作用的活性小分子，分子探针设计则需要额外引入一个光交联基团：活性小分子作为探针中的"结合基团"特异性识别靶蛋白并发生非共价结合，拉近光交联基团与靶蛋白的空间距离，经紫外照射后，光交联基团产生自由基并与空间邻近的氨基酸发生交联，从而实现探针与靶蛋白的共价标记。

AfBPP也被称作化合物中心的化学蛋白质组学(Compound-centric chemical proteomics, CCCP)。该方法早期的研究策略是将天然产物通过化学方法共价固定化于生物相容的惰性树脂上，再用这种树脂作为诱饵来钓取活性蛋白质组中能与之产生相互作用的蛋白质。另一种广泛使用的亲和纯化方法是将天然产物与生物素相连，然后通过固载链霉亲和素的亲和层析进行分离富集。这种连接方式的优势在于：生物素修饰的天然产物可以在纯化分离之前，与细胞或组织裂解液中的蛋白质充分接触，甚至可以直接进入细胞与靶蛋白发生结合。

Figure 6 ABPP与CCCP方法流程^[6]

03    化学蛋白质组学方法应用

化学蛋白质组学技术在创新药物研发和化学生物学研究中有着广泛应用，核心应用场景包括：

❶ 已知功能药物的靶点鉴定

这是目前最常见的应用场景。对于天然产物、小分子抑制剂等活性化合物，在明确其细胞或个体水平药效后，需要通过化学蛋白质组学鉴定其在细胞内的直接作用靶点，这对于理解药物作用机制、优化药物结构、开发衍生物都至关重要。非衍生化方法适合快速筛选，衍生化方法可以获得更高的鉴定准确度。

❷ 已知功能蛋白的配体筛选

以目标蛋白为中心，从天然产物库或合成化合物库中筛选能够特异性结合该蛋白的活化或抑制分子，是创新药物先导化合物发现的重要途径。结合化学蛋白质组学技术，可以在全蛋白质组背景下验证化合物对靶蛋白的选择性，减少脱靶效应。

❸ 代谢物靶点组分析

近年来，代谢组学研究发现了许多具有生物学活性的小分子代谢物，但大部分代谢物的作用靶点并不清楚。化学蛋白质组学技术特别适合系统解析细胞内代谢物-蛋白相互作用网络，揭示代谢物在信号通路调控中的新功能，这也是当前化学生物学领域的研究热点。

❹ 活性蛋白功能位点鉴定

对于酶类等活性蛋白质，鉴定其催化活性中心、共价药物结合位点对于理解酶催化机制、开发靶向共价抑制剂都非常关键。基于活性的蛋白质谱分析（ABPP）能够直接对活性位点进行标记鉴定，这是其他方法难以替代的优势。

❺ 探针分子反应性评估

在共价药物研发过程中，需要评估共价弹头对靶点的选择性以及在全蛋白质组范围内的交叉反应性，化学蛋白质组学技术能够直接定量分析探针分子在整个蛋白质组中的反应谱，为共价药物结构优化提供数据支持。

04    总结

本文系统介绍了当前化学蛋白质组学领域用于药物靶点鉴定的主流技术。这些方法各具特色，在实际应用中各有优劣：

无衍生化方法的优势在于：直接使用配体化合物本体进行实验，无需对化合物结构进行修饰，操作简单便捷，可以实现大规模、高通量分析；但由于缺乏靶蛋白富集过程，更容易受到背景干扰，假阳性结果相对较多。

衍生化方法通过对靶蛋白的特异性富集，显著提高了鉴定灵敏度，并且ABPP类方法还能够实现对共价化合物作用位点的精确鉴定；但这类方法需要对化合物结构进行改造，这个过程不仅增加了合成工作量，还可能对化合物的原有活性产生影响，此外，富集结合质谱定量的实验流程较为繁琐，结合点击化学的定量分析成本较高，难以应用于大规模筛选。

尽管存在一些局限性，化学蛋白质组学技术仍然是当前药物靶点鉴定领域不可或缺的核心技术。在实际研究中，研究者可以根据实验需求和技术条件选择合适的研究方法，甚至可以结合多种方法互补优势，从而提高结果的准确性和可靠性。

展望未来，随着质谱仪器灵敏度不断提高、样品处理方法不断优化，化学蛋白质组学技术的检测深度和准确度都会进一步提升，必将在创新药物研发，特别是从天然产物和传统药物中发现创新药物的过程中发挥越来越重要的作用。

撰稿人：程锐锋

审核人：韩强强 王亮节

参考文献

• [1] Meissner, Felix et al. “The emerging role of mass spectrometry-based proteomics in drug discovery.” Nature reviews. Drug discovery vol. 21,9 (2022): 637-654.

• [2] Chin, R., Fu, X., Pai, M. et al. The metabolite α-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature 510, 397–401 (2014). 

• [3] Malinovska, L., Cappelletti, V., Kohler, D. et al. Proteome-wide structural changes measured with limited proteolysis-mass spectrometry: an advanced protocol for high-throughput applications. Nat Protoc 18, 659–682 (2023). 

• [4] Graham M. West, Liangjie Tang, and Michael C. Fitzgerald. Analytical Chemistry 2008 80 (11), 4175-4185.

• [5] Tian, Y., Wan, N., Zhang, H. et al. Chemoproteomic mapping of the glycolytic targetome in cancer cells. Nat Chem Biol (2023). 

• [6] Chen, X., Wang, Y., Ma, N. et al. Target identification of natural medicine with chemical proteomics approach: probe synthesis, target fishing and protein identification. Sig Transduct Target Ther 5, 72 (2020). 

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