实验指南 | 细胞内相分离复合物的直接提取
所属分类： 技术干货
发布时间： 2026-06-05
概要： 如何从生理原生环境中捕获结构完整的内源相分离凝聚体？
上一回咱们聊了怎么在试管里把相分离蛋白纯化成“乖乖单体”。但体外体系终究是个理想化的玩具 —— 细胞里那些关键的翻译后修饰、拥挤的分子环境，通通被丢了。
研究者们当然不满足于此，于是有人开发了直接从细胞/组织中分离内源性相分离复合物的技术。这一技术最大的挑战是什么？凝聚体靠的是弱多价相互作用，稍微一折腾就散了，所有操作都得小心翼翼。
今天丸子就继续给大家介绍细胞内相分离复合物直接提取的三种主流策略：应激颗粒核心的完整分离、1,6-己二醇梯度洗脱探查染色质凝聚体，以及用RIPA区分病理固态聚集体。
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一、应激颗粒核心的完整分离
应激颗粒是由未翻译的mRNA与RNA结合蛋白（如G3BP1）相分离形成的细胞质凝聚体。以下方案基于Jain和Wheeler等（Nature, 2016）的方法，专门提取应激颗粒的致密核心。
诱导：
哺乳动物细胞（如表达G3BP1-GFP的U-2 OS细胞）生长至适当密度，使用亚砷酸钠或热休克处理。
收集：
直接刮取细胞，1,500×g低速离心3分钟，迅速置于液氮中速冻。
丸子敲黑板
绝对禁止在收获阶段使用PBS洗涤细胞 —— PBS会引发饥饿应激，导致假阳性应激颗粒。从刮取到速冻总时间须<10分钟，液氮速冻可瞬时“冻结”相图状态。
裂解液配方：
50mM Tris-HCl (pH 7.4), 100mM醋酸钾, 2mM 醋酸镁, 0.5mM DTT, 50μg/mL肝素, 0.5%NP-40, 1:5000 Antifoam B, 无EDTA蛋白酶抑制剂及RNase抑制剂。
操作：
冰上重悬冻存细胞，使用25G注射器针头冰上反复抽吸5-10次进行机械剪切。
原理：
0.5% NP-40温和溶解细胞膜但不破坏SG核心；肝素作为RNase竞争抑制剂，保护核心mRNA并防止核酸非特异性沉淀。全过程需显微镜追踪GFP信号确保SG核心未解聚。
❶ 1,000×g，4°C离心5分钟 → 弃沉淀（未破裂细胞及核），保留上清。
❷ 18,000×g，4°C离心20分钟 → 收集沉淀（含SG核心）。
❸ 用SG裂解液洗涤沉淀，再次18,000×g离心。
❹ 最终以少量缓冲液重悬沉淀，850×g低速离心2分钟 → 收集富含SG核心的悬浮上清。
机制：
18,000×g可强制沉降兆道尔顿级别的SG核心，去除游离单体蛋白。最后低速离心剔除不溶性重型细胞骨架碎片。
● 向SG核心富集液中加入Dynabeads Protein A磁珠进行预清除。
● 去除磁珠后加入抗GFP抗体，4°C旋转孵育1小时。
● 14,000×g离心去除非结合抗体，再加入新磁珠捕捉抗体-SG复合物，
● 洗涤，收获纯净SG颗粒。
下游应用：
可直接进行蛋白质组学质谱鉴定或RNA测序。
二、基于1,6-己二醇梯度洗脱的染色质凝聚体探查（CHS-MS）
1,6-己二醇（1,6-HD）是个神奇的小分子 —— 它能插入并破坏蛋白质之间由疏水/芳香族残基主导的弱多价网络，从而溶解液态凝聚体。利用不同浓度的1,6-HD，我们可以对染色质相关蛋白（CAPs）进行“流变学分级”，看谁更“粘”。
使用商业化试剂盒在冰上裂解细胞，离心分离胞质与细胞核沉淀。目的很简单：去掉胞浆里游离的相分离蛋白干扰。
IB组分：
用不含1,6-HD的PBS洗涤孵育核沉淀，离心收集上清（代表未发生相分离或结合力极弱的游离核蛋白）。
2%、5%、10% 1,6-HD洗脱：
依次使用含对应浓度(w/v) 1,6-HD的PBS重悬核沉淀，4°C孵育5分钟，14,000×g离心收集上清。
流变学解读：
❶ 2% 1,6-HD融解高流动性液滴，富集IDRs/LCDs比例极高的蛋白。
❷ 10% 1,6-HD破坏交联度更高、趋于凝胶态的疏水网络。
控制条件：
必须严格控制1,6-HD作用时间及浓度上限（>5%时需警惕）。
病理学警告：
高浓度1,6-HD（>5%）处理时间过长，会改变体系介电常数并剥离水分子层，导致染色质异常极度浓缩固化 —— 这跟相分离融解恰恰相反，会产生假阴性。所以结论必须配合体外纯化重构验证。
三、基于强去垢剂RIPA缓冲液的病理学液-固相转变分析
在ALS等神经退行性疾病里，液态蛋白（比如TDP-43）会变成不可逆的固态淀粉样聚集体。RIPA缓冲液分级提取，能清晰地把生理性可溶组分和病理性不溶组分区分开。
● RIPA裂解液：50mM Tris-HCl (pH 8), 250mM NaCl, 1% Triton-X 100, 0.1% SDS, 0.25% 脱氧胆酸钠，冰上孵育30分钟。
● 14,000×g离心30分钟。
❶ 上清=RIPA可溶性组分：正常生理性液态相分离网络被彻底瓦解成游离单体。
❷ 沉淀=RIPA不溶性组分：抵抗RIPA溶解的成分，说明蛋白质已经发生了深度不可逆结构演变（纤维化等）。
● 向沉淀中加入含1% SDS或高浓度尿素的强变性上样缓冲液，100°C剧烈煮沸10分钟以上强制溶解。
病理学意义：
病在ALS小鼠脑组织中，RIPA不溶性沉淀里TDP-43的富集程度直接映射运动神经元退化中大分子聚集毒性的严重程度。
结语
总结一下，从细胞里直接抓相分离复合物，核心任务就四个字：“固定原貌”。
速冻冻结动力学状态
温和去垢剂+差速离心保护弱相互作用
梯度1,6-HD做流变学剖层
强RIPA区分病理聚集
这些方法让我们能捕获到接近真实生理的互作组图谱。
下一篇，丸子会给大家系统对比一下：相分离蛋白分离与常规目的蛋白分离的底层逻辑到底差在哪？敬请期待～
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参考文献
1. Candelise N, Caissutti D, Zenuni H, et al. Different chronic stress paradigms converge on endogenous TDP43 cleavage and aggregation. Mol Neurobiol. 2023;60(9):3682-3699. doi:10.1007/s12035-023-03455-z.
2. Zhu P, Hou C, Liu M, Chen T, Li T, Wang L. Investigating phase separation properties of chromatin-associated proteins using gradient elution of 1,6-hexanediol. BMC Genomics. 2023;24(1):493. doi:10.1186/s12864-023-09600-1.
3. Wheeler JR, Jain S, Khong A, Parker R. Isolation of yeast and mammalian stress granule cores. Methods. 2017;126:12-17. doi:10.1016/j.ymeth.2017.04.020.
4. Li M, Ren N, Zhang S, et al. Kinesin family member 26A disrupts DNA-dependent protein kinase complex formation to enhance chemoradiotherapy sensitivity in colorectal cancer. Int J Biol Sci. 2026;22(7):3411-3431. doi:10.7150/ijbs.127218.
5. Zheng T, Wake N, Weng SL, Perdikari TM, Murthy AC, Mittal J, Fawzi NL. Molecular insights into the effect of 1,6-hexanediol on FUS phase separation. EMBO J. Published April 25, 2025. doi:10.1038/s44318-025-00431-2.
6. Jayabalan AK, Bhambhani K, Leung AKL. PARP10 is critical for stress granule initiation. Life Sci Alliance. 2025;8(1):e202403026. doi:10.26508/lsa.202403026
7. Yang C, Wang Z, Kang Y, Yi Q, Wang T, Bai Y, Liu Y. Stress granule homeostasis is modulated by TRIM21-mediated ubiquitination of G3BP1 and autophagy-dependent elimination of stress granules. Autophagy. 2023. doi:10.1080/15548627.2022.2164427
8. Kosmacz M, Skirycz A. The isolation of stress granules from plant material. Curr Protoc Plant Biol. 2020;5:e20118. doi:10.1002/cppb.20118
关键词： 实验指南 | 细胞内相分离复合物的直接提取
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