今天为大家解读一项发表于免疫学顶级期刊Nature Immunology的重磅研究，标题为“Targeting NK cell CLEC12B enhances cancer immunotherapy”。该研究团队聚焦于肝细胞癌（HCC）中自然杀伤（NK）细胞在肿瘤微环境（TME）中出现的进行性功能障碍，首次发现C型凝集素受体CLEC12B是一个限制NK细胞抗肿瘤免疫的全新抑制性检查点。

本研究由安徽省立医院孙鹏团队主导完成，谱度众合在分子机制解码环节提供的Pull down-MS蛋白互作组学研究解决方案成功确证：CLEC12B的内源性功能配体为脂蛋白脂肪酶（LPL）。这一关键发现为后续阐明肿瘤细胞如何通过LPL-CLEC12B轴触发抑制性信号、导致NK细胞耗竭提供了直接证据。基于此，团队开发了一种高亲和力纳米抗体（H6-Fc），成功逆转了NK细胞的功能障碍，为实体瘤免疫治疗开辟了极具潜力的新策略。

本研究采用“临床多组学分析-靶点配体确证-纳米抗体开发-体内联合免疫治疗”的系统性范式：

❶ 临床与单细胞转录组分析：利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和质谱流式（CyTOF），分析HCC患者肿瘤浸润免疫细胞，锁定在NK细胞中特异性高表达的CLEC12B，并揭示其与患者不良预后的相关性。

❷ 靶点配体筛选与机制确证：利用谱度众合提供的Pull down-MS技术，以CLEC12B-Fc融合蛋白为诱饵，高通量筛选并确证肿瘤细胞表面的LPL为其直接结合配体。随后结合表面等离子体共振（SPR）和免疫印迹实验，系统阐明了LPL-CLEC12B相互作用如何阻断NK细胞杀伤信号通路。

❸ 治疗性纳米抗体开发：建立羊驼免疫噬菌体展示文库，筛选并工程化改造出具有极高亲和力、且去除Fc受体介导效应的靶向纳米抗体（H6-Fc）。

❹ 体内抗肿瘤转化评估：在多种鼠源皮下肿瘤模型（如Hepa1-6、MC38）、转移模型以及人源化NSG小鼠模型中，系统评估了CLEC12B基因敲除及H6-Fc纳米抗体单药或联合PD-1阻断的治疗效果。

研究团队通过对189例肝细胞癌（HCC）患者样本进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）发现，CLEC12B超过95%限制性表达于CD45+免疫细胞中。进一步对789例患者大队列转录组数据分析显示，免疫细胞中CLEC12B高表达与患者总生存期（OS）显著变差相关，而肿瘤细胞自身的CLEC12B表达水平与预后无关，提示该分子主要在免疫细胞中发挥促癌作用。

此外，肿瘤微环境可特异性诱导NK细胞CLEC12B上调与功能衰竭：质谱流式（CyTOF）与流式细胞术结果表明，CLEC12B在肿瘤微环境中特异性高表达于肿瘤浸润NK细胞，在巨噬细胞和中性粒细胞中无明显异常。高表达CLEC12B的NK细胞毒性通路下调，且与TIGIT、PD-1、TIM-3、LAG-3等耗竭受体表达呈显著正相关。值得注意的是，敲除CLEC12B可强效恢复NK细胞的抗肿瘤活性：在Hepa1-6肝癌、MC38结直肠癌、B16-F10黑色素瘤等多种小鼠模型中，全身性敲除或NK细胞特异性敲除CLEC12B均可显著抑制肿瘤生长、减少肺/肝转移并延长生存期。

进一步骨髓与脾脏分析证实，敲除CLEC12B并不影响NK细胞发育、成熟及亚群分布，而是通过解除抑制信号（恢复IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素等核心杀伤因子分泌，并上调黏附与迁移相关通路）从而增强NK细胞的抗肿瘤活性。

（2）高亲和力纳米抗体（H6-Fc）的成功开发及其在联合治疗中的强大协同增效

基于明确的靶点价值，团队利用重组hCLEC12B-Fc免疫羊驼，并通过迭代噬菌体展示技术筛选出一款高亲和力（KD=47.1 nM）纳米抗体H6-Fc。该抗体对人源和鼠源CLEC12B均具有交叉结合活性，且不与结构相似的CLEC12A发生非特异性结合。为避免Fc受体介导的潜在副作用，团队前瞻性地引入了Fc片段LALA突变（L234A/L235A）。

体外实验证实，极低浓度的H6-Fc即可显著恢复并增强NK细胞对K562、THP-1等靶细胞的杀伤能力，同时有效促进NK细胞的增殖及效应分子的释放。在活体模型中，H6-Fc不仅作为单药展现出显著的抑瘤与延长生存期作用，更展现出了打破免疫耐受壁垒的协同治疗潜力。在Hepa1-6、H22和MC38实体瘤模型中，H6-Fc联合抗PD-1阻断疗法，成功实现了对先天免疫（NK细胞）和适应性免疫（T细胞）的双重激活，肿瘤消退效果显著优于任一单药。此外，该纳米抗体还能与化疗药物（如帕比司他）在C1498白血病模型中产生强烈的协同增效。

为揭示CLEC12B是如何被激活从而导致NK细胞耗竭的，寻找其肿瘤细胞表面的内源性“配体”成为了整个研究必须跨越的机制鸿沟。在这一最具挑战性的环节，谱度众合提供的Pull down-MS互作蛋白定性筛选技术发挥了关键作用：以重组的CLEC12B-Fc融合蛋白为诱饵，在天然HepG2肝癌细胞膜裂解液中实施无偏倚的高通量捕获，从海量背景蛋白中，精准锚定脂蛋白脂肪酶（LPL）为首选功能性配体。基于质谱数据的指引，随后的SPR实验完美验证了LPL与CLEC12B之间存在直接的物理互作，且分子对接与Co-IP进一步证实了该结果。流式与共聚焦显微镜发现，LPL并非游离，而是通过硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）牢牢锚定在肿瘤细胞膜表面，为跨细胞识别提供了结构基础。

进一步的机制实验彻底阐明了这套免疫逃逸系统：当肿瘤细胞表面的LPL与NK细胞表面的CLEC12B结合后，触发了依赖于ITIM基序的强烈抑制信号。这导致磷酸酶SHP-1过度磷酸化，进而全面切断了下游的SYK-PI3K-AKT-S6激活网络，最终造成了NK细胞脱颗粒受损及细胞因子分泌的断崖式下跌，从分子源头刻画了NK细胞功能障碍的底层逻辑。

（4）抗CLEC12B在人源化模型中重塑NK细胞功能，展现卓越安全性与泛癌种转化前景

为了评估临床转化价值，研究团队构建了移植有人源NK细胞的免疫缺陷重构小鼠模型（HepG2-hNK-NSG），H6-Fc治疗在该模型中显著缩减了肿瘤负荷并延长了生存期。深度表型分析揭示，H6-Fc能够“重塑”浸润NK细胞的受体图谱 —— 大幅下调TIGIT/NKG2A等抑制性受体，上调NKG2C/NKG2D等激活受体，并使CD16、IFN-γ和颗粒酶B的表达全面升高。

在剂量递增毒理实验中，小鼠未出现任何体重下降，肝酶（AST/ALT）指标维持在健康水平，心肝脾肺肾的组织病理学检测（H&E染色）均未见任何毒性损伤，说明其极佳的药理安全性。最后，基于TCGA数据库的泛癌分析及多中心组织微阵列（TMA）的免疫组化验证证实，除肝癌外，CLEC12B在肾透明细胞癌（KIRC）、甲状腺癌（THCA）及食管癌（ESCA）等多种常见实体瘤中均呈现显著高表达。这一发现从临床维度上确认了靶向CLEC12B作为一种广谱型实体瘤免疫治疗策略的重大临床价值。

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研究结论

本研究首次确立了CLEC12B作为NK细胞特异性抑制性检查点的核心地位，完整阐明了“肿瘤表面LPL结合NK细胞CLEC12B→招募SHP-1→抑制SYK-PI3K-AKT信号→NK细胞功能耗竭”的分子机制。

谱度众合提供的Pull down-MS蛋白互作组学研究解决方案作为整个研究的“源头引擎”，精准鉴定出LPL这一关键配体，为机制解析和药物开发提供了不可或缺的核心证据。基于这一发现开发的抗CLEC12B纳米抗体，不仅单药疗效显著，还能与PD-1抑制剂、化疗药物产生协同作用，为肝癌、肾癌、甲状腺癌等多种实体瘤的免疫治疗提供了全新的靶点和策略，具有重要的临床转化价值。

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