在抗菌药物研发中，如何精准找到细菌入侵的“钥匙”？益生菌的健康益处，究竟由哪个表面蛋白与肠道上皮“对话”？肿瘤微生物组里，特定细菌又是通过什么分子与免疫细胞受体博弈？

这些前沿领域共同指向一个核心突破口：细菌表面蛋白与宿主细胞膜受体的特异性互作。它不仅解释了细菌精准识别并操控宿主细胞的分子逻辑，更是设计靶向抗菌肽、构建工程化益生菌、开发微生物联合免疫疗法的直接分子基础。

今天，我们就以香港中文大学2023年和2025年发表在《Cancer Cell》的两篇里程碑式研究为核心案例，系统拆解“细菌表面蛋白–宿主受体”互作分子的完整鉴定流程。希望能为大家的课题设计，提供可落地的新思路。你把理论快速转化为可执行的实验方案。

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在启动实验前，必须先锚定研究体系的核心特征，避免盲目开展大规模筛选：

❶ 互作的方向性：是细菌表面蛋白结合宿主受体，还是宿主分泌蛋白结合细菌表面受体？

❷ 互作的特异性：是否存在细胞/组织特异性？是否具有物种/菌株特异性？

❸ 互作的功能关联性：鉴定到的分子对是否直接介导了细菌的生物学效应（如抗菌、抗肿瘤、免疫调节）？

两篇经典研究都完美遵循了"功能先行→互作筛选→分子验证→体内确证"的逻辑链条：

先发现Carnobacterium maltaromaticum（麦芽香肉杆菌）仅在雌性小鼠中抑制结直肠癌，进而追溯到雌激素调控的细菌定植差异，最终鉴定出细菌DD-CPase-宿主SLC3A2互作介导定植

先发现Clostridium butyricum（酪酸梭菌）能增强PD-1抑制剂疗效，进而发现细菌能特异性定植于结直肠肿瘤组织，最终鉴定出细菌secD-宿主GRP78互作介导抗肿瘤免疫

优先使用与研究功能相关的原代细胞或永生化细胞系（如两篇研究均使用结直肠癌细胞系HCT116、DLD1和正常肠上皮细胞NCM460作为对照）

● 感染复数（MOI）：通常设置10:1、50:1、200:1三个梯度，两篇研究均使用MOI=200进行细菌黏附实验

● 共培养时间：黏附实验通常2-4小时，避免细菌过度增殖导致非特异性结合

● 气体环境：厌氧菌必须在厌氧工作站中完成共培养

必须设置无细菌空白对照和非相关细菌对照

在开展大规模筛选前，必须先通过直观方法确认直接互作的存在：

细菌黏附计数实验、透射电镜（TEM）、扫描电镜（SEM）、荧光原位杂交（FISH）

❶ 共培养后用PBS严格洗涤5次，去除未黏附的细菌

❷ 用TEM观察细菌与细胞膜的接触位点，用FISH标记细菌在细胞/组织中的定位

❸ 用活/死细菌染色区分黏附的活菌和死菌

这一步的核心是尽可能富集特异性互作蛋白，同时最大限度减少非特异性结合。两篇研究均采用了双向生物素标记pull-down策略，这是目前鉴定跨物种蛋白互作的金标准方法。

方法1：生物素标记细菌表面蛋白→pull-down宿主细胞受体

● 使用膜不透性的Sulfo-NHS-LC-Biotin（仅标记细胞表面的伯胺基团），避免标记胞内蛋白

● 标记条件：4℃孵育2-4小时，用100mM甘氨酸终止反应，去除未结合的生物素

● 提取细菌表面膜蛋白：用含1% Triton X-100的裂解液提取，离心取上清

● 用专用的细胞表面蛋白分离试剂盒提取宿主细胞膜蛋白，避免胞内蛋白污染

● 定量后分装保存于-80℃，避免反复冻融

● 将生物素标记的细菌表面蛋白与链霉亲和素磁珠孵育，制备亲和磁珠

● 加入宿主细胞膜蛋白，4℃旋转孵育过夜

● 用含0.1% Tween-20的PBS洗涤磁珠5-6次，严格去除非特异性结合蛋白

● 用2×SDS上样缓冲液洗脱结合蛋白，95℃变性5分钟

方法2：生物素标记宿主细胞膜蛋白→反向pull-down细菌表面配体

这是排除假阳性的关键步骤！仅做单向pull-down会有大量非特异性结合，双向验证才能得到可靠的候选分子。

操作流程与方法1完全对称：先生物素标记宿主细胞膜蛋白，再pull-down细菌表面蛋白。

方法3：Far-Western Blot（辅助验证）

将一方的蛋白通过SDS-PAGE分离并转膜，用另一方的生物素标记蛋白作为探针进行杂交，能直观看到互作蛋白的分子量，帮助缩小质谱鉴定的范围。两篇研究均通过Far-Western Blot先确定了互作蛋白的条带位置，再切取对应条带进行质谱分析，大幅提高了鉴定效率。

将SDS-PAGE分离后的目标条带切下，用胰蛋白酶进行胶内酶解，提取肽段

如果pull-down产物量较少，可直接进行溶液内酶解，使用超滤管去除去污剂

● 全程使用无蛋白酶的耗材和试剂，避免角蛋白污染

● 设置空白对照（仅磁珠+缓冲液），质谱结果中扣除对照中的污染蛋白

Orbitrap Exploris、TripleTOF 6600（两篇研究均使用TripleTOF 6600）

● 宿主蛋白：Uniprot人类/小鼠数据库

● 细菌蛋白：对应菌株的全基因组数据库

设置假发现率（FDR）<1%，至少匹配2条独特肽段

两篇研究都采用了多维度交叉筛选，大幅降低了假阳性：

❶ 双向pull-down交集筛选：只保留在正向和反向pull-down中都出现的蛋白

❷ 功能相关性筛选：优先选择膜蛋白、受体蛋白、黏附分子

❸ 表达特异性筛选：结合转录组/蛋白质组数据，筛选在靶细胞中高表达的蛋白

从3个候选蛋白（SLC3A2、EF-hand D2、Galectin-3）中，筛选出仅SLC3A2具有性别特异性表达，且启动子区有雌激素受体结合位点

筛选出仅GRP78在结直肠癌细胞膜上高表达，而在正常肠上皮细胞膜上不表达

❹ 已知互作数据库验证：查询STRING、IntAct等数据库，排除已有报道的非特异性互作

质谱鉴定只是起点，必须通过多方法验证才能确认直接互作，并证明其功能意义。

这是区分"无意义互作"和"功能互作"的关键：

● 敲除宿主受体基因，检测细菌的黏附能力和生物学效应是否消失

● 敲除细菌表面蛋白基因，检测细菌的功能是否丧失

● 两篇研究均使用CRISPR-Cas9技术敲除了宿主受体基因，证实敲除后细菌无法黏附，且失去了抗肿瘤效应

❷ 回补验证：

● 在敲除细胞中回补野生型受体，观察功能是否恢复

● 用重组蛋白预处理细胞/细菌，模拟互作的生物学效应

● 2025年研究将secD基因导入大肠杆菌，发现重组大肠杆菌获得了抗肿瘤和增强PD-1疗效的能力

❸ 体内验证：

● 构建基因敲除动物模型，验证互作在体内的功能

● 两篇研究均在小鼠模型中验证了互作分子对细菌定植和抗肿瘤效应的影响

寻找细菌-宿主互作关键分子对需秉持“大胆假设、小心求证”的原则，两篇《Cancer Cell》研究为该领域树立了标准化范式。

两篇研究均以生物素标记pull down-MS为核心筛选技术，流程各有侧重：

● 2023年麦芽香肉杆菌研究先通过该技术鉴定宿主受体蛋白，再结合IP-MS锁定细菌表面互作蛋白；

● 2025年酪酸梭菌研究则先筛选细菌膜蛋白，再通过反向pull down联合GST pull down确定宿主靶蛋白。

二者均遵循“功能先行→互作筛选→分子验证→体内确证”的逻辑。其成功关键在于严谨的实验设计与多维度交叉验证，建议相关研究先建立稳定表型模型，再逐步深入分子机制。

如果你正在开展相关研究，建议先从建立可靠的表型模型入手，再逐步推进到分子机制。同时，不要忽视阴性结果的价值，它们往往能帮你排除错误的方向，找到真正的关键分子。

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