今天为大家解读一项发表于生物学权威期刊International Journal of Biological Sciences的研究，标题为“N-Homocysteinylation of HMGB1/2 Promotes Corpus Cavernosum Endothelial Senescence in Erectile Dysfunction”。该研究聚焦于同型半胱氨酸（Hcy）在衰老相关勃起功能障碍（ED）中的致病机制，首次揭示了甲硫氨酰-tRNA合成酶1（MARS1）介导的 N-同型半胱氨酰化（K-Hcy）是驱动内皮细胞衰老的核心途径。

本研究由华中科技大学同济医学院附属同济医院崔凯团队主导完成，谱度众合提供的N-同型半胱氨酰化修饰组学分析、PL-MS蛋白邻近表达筛选解决方案，成功帮助研究团队从复杂的细胞外基质和内环境网络中，精准鉴定了HMGB1/2这一关键的K-Hcy修饰靶点，并深度解析了其修饰位点及下游与SLIT2蛋白的动态互作网络。这一系列高质量的质谱数据为阐明“Hcy-MARS1-HTL-HMGB1/2-SLIT2”这一新型衰老相关微环境调控机制提供了不可或缺的核心证据，并为老龄化人群ED的治疗提供了NAC联合他达拉非的创新干预策略。

本研究采用“临床队列分析-多组学靶点筛选-修饰与互作机制解析-体内联合用药转化”的系统性研究范式：

❶ 临床与表型确证：结合临床回顾性病例对照研究与单细胞RNA测序（scRNA-seq），明确Hcy与年龄的交互作用，证实其加速中老年大鼠海绵体内皮衰老。

❷ 靶点筛选与修饰鉴定：利用谱度众合提供的N-同型半胱氨酰化修饰组学分析策略，精准锁定HMGB1/2为内皮细胞中的核心K-Hcy修饰靶点，并进一步明确其具体的修饰位点。

❸ 互作网络与机制解析：结合定点突变、CUT&Tag及谱度众合提供的PL-MS蛋白邻近表达筛选解决方案，阐明K-Hcy修饰驱动HMGB1/2出核，并在胞外与SLIT2蛋白结合，阻断其抗炎信号的分子机制。

❹ 药理转化研究：在HHcy中老年大鼠模型中，验证了MARS1竞争性抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）联合他达拉非的抗内皮衰老及勃起功能恢复作用。

临床回顾性病例对照研究（纳入ED患者与对照各240名）显示，血浆Hcy水平是ED的独立危险因素，且该关联在50岁以上人群中更为显著。限制性立方样条（RCS）回归分析进一步揭示了Hcy与年龄的非线性交互作用：在50岁以上人群中，随着Hcy水平升高，ED风险呈陡峭的非线性上升趋势。

动物学实验与临床表型高度一致。经1%甲硫氨酸诱导的中老年HHcy大鼠模型，表现出最严重的勃起血流受损及海绵体内压（ICP）下降；Masson染色显示其海绵体组织存在显著的胶原/平滑肌比例失衡及血管重塑。单细胞RNA测序（scRNA-seq）及拟时间轨迹分析进一步证实，HHcy显著加速了内皮细胞亚群向衰老状态的转变，并伴随着衰老标志基因（如Cdkn1a、H2ax、Il6）的急剧上调及衰老相关分泌表型（SASP）的激活。

（2）双重组学策略：揭示MARS1-HTL轴并锁定核心K-Hcy靶点HMGB1/2

进一步寻找介导HHcy内皮毒性的关键分子。研究团队首先在自然衰老大鼠的海绵体中证实了Hcy、HTL以及K-Hcy修饰的年龄依赖性病理积累。随后，在体外原代细胞传代模型中发现，MARS1的表达随衰老上调，进而驱动K-Hcy修饰的发生。在这一关键的靶点发现阶段，谱度众合提供的N-同型半胱氨酰化修饰组学分析发挥了决定性作用：

一方面，通过基于IP抗体富集的“N-同型半胱氨酰化修饰组学分析”，在全蛋白质组层面高通量描绘了内皮细胞的K-Hcy修饰全景，成功鉴定出1036个发生修饰的蛋白质。另一方面，为了排除背景干扰，采用基于叠氮探针的化学选择性标记技术，精准捕获了Hcy处理前后发生显著差异修饰的284个蛋白质。

最后，通过将这两种维度的组学数据与衰老数据库（Aging Atlas）进行交叉重叠分析，研究团队从复杂的信号网络中成功锁定高度保守的核蛋白HMGB1/2，将其确认为内皮衰老过程中的核心K-Hcy修饰靶标。

明确靶点后，解析修饰如何改变蛋白功能成为关键。研究团队利用谱度众合提供的蛋白质修饰鉴定服务，对HMGB1/2进行了超高分辨率的修饰位点鉴定：明确了HMGB1的K12、K65、K68，以及HMGB2的K12、K65、K76、K157是发生高丰度K-Hcy修饰的核心赖氨酸残基。

进一步的功能验证中，CUT&Tag测序分析显示，Hcy或HTL处理显著削弱了HMGB1/2与DNA的结合信号。结合共聚焦显微镜观察，确证该修饰驱动了HMGB1/2发生显著的核-质转位及胞外释放。此外，定点突变验证还显示，将关键赖氨酸突变为精氨酸，可完全逆转核转位；而突变为色氨酸则导致蛋白滞留胞质。最终，结合Alpha Fold3分子对接预测，证实K-Hcy修饰直接破坏了HMGB1/2与入核转运蛋白IMA5的结合亲和力，从而主导其核耗竭。

（4）PL-MS揭秘胞外互作网络：修饰型HMGB1/2阻断SLIT2抗炎信号

Cell Chat单细胞通讯分析提示，中老年HHcy组的细胞间通讯异常活跃。为了探究被释放到胞外的K-Hcy-HMGB1/2如何重塑微环境，研究团队巧妙引入了谱度众合的PL-MS蛋白邻近表达筛选解决方案。

利用构建的重组FLAG-HMGB1/2-TurboID融合蛋白，研究团队在活细胞水平实现了对胞外微环境中瞬时微弱互作网络的高通量、高灵敏度捕获，精准筛选出内皮细胞分泌的重要抗炎因子SLIT2。随后的GST pull-down与双分子荧光互补（BiFC）实验证实：携带K-Hcy修饰的胞外HMGB1/2能够直接结合SLIT2的N端，并强力破坏SLIT2与受体ROBO4的正常互作。这一互作模式的改变，彻底阻断了SLIT2-ROBO4介导的抗炎信号通路，进而诱导并放大SASP效应及MARS1的正反馈表达，加剧旁分泌衰老级联反应。

（5）药理转化：NAC靶向阻断MARS1协同他达拉非逆转ED

基于深度的分子机制解析，研究进一步评估了通过N-乙酰半胱氨酸（NAC）竞争性抑制MARS1的治疗潜力。体内外实验证实，NAC能够显著降低HTL浓度，从源头阻断大鼠海绵体中K-Hcy修饰的异常蓄积。

在功能学与组织学转化评估中，NAC单药即可有效改善中老年HHcy组大鼠的阴茎勃起血流，上调抗衰老标志物LaminB1，下调衰老标志物p21，并显著减轻海绵体纤维化。更重要的是，NAC与PDE5抑制剂他达拉非的三重联合用药表现出卓越的协同增效作用，促使海绵体结构完整性与血流动力学指标得到最大程度的恢复。这一发现为突破临床上中老年HHcy相关ED的治疗瓶颈，提供了强有力的药理学转化依据。

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研究结论

本研究系统阐明了高同型半胱氨酸（HHcy）诱导中老年勃起功能障碍（ED）的全新机制，并提出了突破传统降Hcy疗效瓶颈的新型联合治疗策略：

核心机制：衰老上调MARS1表达，加速生成高反应性的HTL，导致核内HMGB1/2发生特异性的N-同型半胱氨酸修饰（K-Hcy）。修饰后的HMGB1/2向胞外释放，结合并拮抗抗炎因子SLIT2，阻断SLIT2-ROBO4通路，进而放大内皮细胞的衰老相关分泌表型（SASP）。在此机制的破译中，谱度众合提供的N-同型半胱氨酰化修饰组学分析服务发挥了关键作用，精准锁定了HMGB1/2为K-Hcy核心靶点并解析了关键赖氨酸修饰位点；且提供的PL-MS蛋白邻近表达筛选解决方案则成功捕获了HMGB1/2与SLIT2在胞外的瞬时动态互作网络。

临床前景：本研究揭示了该修饰通路是伴有HHcy的中老年ED患者的重要药理学脆弱点。证明了“靶向阻断K-Hcy（NAC）联合PDE5抑制剂（他达拉非）”的双重干预方案具有显著的协同增效作用，为克服传统单纯依赖叶酸降Hcy的治疗局限，提供了极具临床转化潜力的全新治疗框架。

参考文献

• Hu P, Fu S, Li B, et al. N-Homocysteinylation of HMGB1/2 Promotes Corpus Cavernosum Endothelial Senescence in Erectile Dysfunction. Int J Biol Sci. 2025;21(15):6723-6744. Published 2025 Oct 20. doi:10.7150/ijbs.119514