2013 年《Science》一篇研究，让细胞热迁移分析（CETSA）成为药物靶标验证的 “新宠”。它的原理简单到惊艳：药物与靶蛋白结合后，会给蛋白 “加一层热保护”—— 梯度温度处理后，结合态蛋白比游离态更易留在可溶组分里，用 Western blot 检测目标蛋白的含量变化，就能直接证明细胞内药物与靶标的真实结合。这种 “不标记、贴生理” 的优势，让 CETSA 迅速火遍科研圈。

可火着火着，CETSA 的 “短板” 也藏不住了 —— 它依赖 WB 检测，一次实验最多验证 3-5 个靶蛋白，像个 “单点狙击手”。面对表型筛选得到的活性化合物，想找出 “未知的作用靶标”？CETSA 完全无从下手，这成了药物机制研究的 “拦路虎”。

直到 2014 年，Savitski 团队在《Science》再献突破：他们把 CETSA 的 “热稳定原理” 与定量质谱 “嫁接”，开发出热蛋白组分析（TPP）。通过 TMT 重同位素标记不同温度的样品，再用质谱检测，一次性就能画出全蛋白组的热稳定性图谱 ——相当于给 CETSA 从 “单点狙击” 升级成 “全景扫描”，未知靶标的发现终于不再是难题！

在系统梳理 Nat Methods、Mol Syst Biol 等 7 篇文献后，我将两项技术的核心差异总结为以下 4 个维度：

【在神经退行性疾病研究中，研究者用 TPP 分析脱氧胆酸（DCA）处理的 SH-SY5Y 细胞，一次性鉴定出 65 个潜在靶蛋白，其中尼卡斯特林（γ- 分泌酶亚基）的发现直接揭示了肠道菌群代谢物与 amyloid-β 生成的关联。这种无偏倚发现能力，是 CETSA 无法企及的。】

● CETSA 实验设计相对简单：细胞经药物处理后，设置 6-8 个温度梯度（通常 37-67℃）加热，裂解离心后取上清做 WB 即可，试剂成本主要消耗在抗体上。

● TPP 则涉及复杂的样品处理流程：需对每个温度点的样品进行酶解、TMT 标记、分级分离后再做质谱检测。

● CETSA：以温度为横坐标、蛋白相对含量为纵坐标绘制曲线，药物处理组的熔解温度（Tm）较对照组升高 1-2℃以上，即可判定靶标结合阳性。我实验室的常规操作是设置 3 个生物学重复，用 GraphPad Prism 拟合曲线即可。

● TPP：数据处理需要专业的生物信息学支撑，首先用 MaxQuant 等软件定量肽段，再通过 TPP 包拟合每个蛋白的熔解曲线，计算 Tm 值及变化，最后结合统计检验筛选差异稳定蛋白。更复杂的是 2D-TPP 设计，需同时设置温度梯度和药物浓度梯度，数据维度翻倍，解析难度显著增加。

CETSA 在组织样本检测中更具优势，只需少量临床样本（约 10mg）即可完成检测，适合临床前药物的靶标验证。而 TPP 对样本量要求较高（通常需 10^7 个细胞或 50mg 组织），但在特殊亚细胞结构研究中表现更优 —— 2021 年 Nat Methods 报道的细胞表面 TPP（CS-TPP），通过富集细胞膜蛋白，成功捕获了 TGF-β 受体抑制剂诱导的 MCT1/3 转运体内化过程，揭示了药物的抗转移机制。

结合文献案例和自身经验，我将技术选择归纳为以下 2 类典型场景：

当研究目标是验证 “化合物 A 是否结合蛋白 X” 或比较不同衍生物的结合亲和力时，CETSA 是最优选择。其优势在于：

● 无需依赖质谱平台，普通分子生物学实验室即可开展；

● 可在细胞、组织甚至类器官中进行，贴近生理环境；

● 能快速筛选化合物浓度范围，为后续实验提供参数。

【例如验证某 Syk 激酶抑制剂的靶标结合时，我用 CETSA 设置 0-10μM 药物浓度梯度，发现 5μM 以上即可显著升高 Syk 的 Tm 值，后续的激酶活性实验便围绕该浓度范围设计。】

TPP的应用场景概览图（Expert Rev Proteomics. 2024）

【这类研究若用 CETSA 则完全无法实现 —— 谁也无法提前预测并制备上百种抗体。需要注意的是，TPP 筛选得到的候选靶标需用 CETSA 进行二次验证，这是发表高分文章的必备流程。】

回顾 CETSA 到 TPP 的十年发展，技术进化的核心逻辑始终是 “更全面、更精准、更贴近生理”。目前 TPP 的最新突破是定量靶标占有率检测 —— 通过 2D-TPP 同时设置温度和药物浓度梯度，可计算药物在细胞内的靶标结合率（TO），这对优化药物剂量具有重要指导意义。

作为一线研究者，我最深的体会是：没有完美的技术，只有适配的策略。CETSA 的 “精准打击” 与 TPP 的 “全景扫描” 恰好形成互补。未来随着单细胞 TPP、空间 TPP 等新技术的出现，热蛋白组分析必将在精准医疗领域发挥更核心的作用。

如果你正在设计相关实验，欢迎在评论区分享具体场景，我们可以一起探讨最优方案！也期待大家交流 TPP 数据分析中的实战技巧～

推荐

谱度众合 ：最经典、主流的药物靶点筛选技术——TPP热蛋白组分析

✔ 全面直接筛选真实药靶组合：蛋白质组水平筛选药物结合的蛋白靶点，全面覆盖治疗靶点与脱靶靶点；使用药物分子本体进行试验，无需设计合成分子探针，药靶结合更真实

✔ 多种数据分析策略：结合蛋白热变性曲线分析和非参数分析方法（NPARC），全面捕获潜在药物靶点

✔ 多种生信分析数据库挖掘辅助筛选：对潜在药物靶点进行生信分析与数据库挖掘，辅助最终药物靶点的确认

✔ 多种衍生技术可选：除常规温度范围（TPP-TR）、药物浓度范围（TPP-CCR）、两者结合（2D-TPP）的常规热蛋白组分析方法外，还可进行单温度点（ITSA）、多温度点混合（PISA）等高通量热蛋白组分析方法

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参考文献

• [1] Kalxdorf M, Günthner I, Becher I, et al. Cell surface thermal proteome profiling tracks perturbations and drug targets on the plasma membrane. Nat Methods. 2021;18(1):84-91. doi:10.1038/s41592-020-01022-1

  
  

• [2] Zhang L, Wang Y, Zheng C, et al. Cellular thermal shift assay: an approach to identify and assess protein target engagement. Expert Rev Proteomics. 2024;21(9-10):387-400. doi:10.1080/14789450.2024.2406785

  
  

• [3] Mateus A, Kurzawa N, Becher I, et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 2020;16(3):e9232. doi:10.15252/msb.20199232

  
  

• [4] Kurzawa N, Leo IR, Stahl M, et al. Deep thermal profiling for detection of functional proteoform groups. Nat Chem Biol. 2023;19(8):962-971. doi:10.1038/s41589-023-01284-8

  
  

• [5] Ruan C, Ning W, Liu Z, et al. Precipitate-Supported Thermal Proteome Profiling Coupled with Deep Learning for Comprehensive Screening of Drug Target Proteins. ACS Chem Biol. 2022;17(1):252-262. doi:10.1021/acschembio.1c00936

  
  

• [6] Tu Y, Tan L, Tao H, Li Y, Liu H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 2023;116:154862. doi:10.1016/j.phymed.2023.154862

  
  

• [7] George AL, Sidgwick FR, Watt JE, et al. Comparison of Quantitative Mass Spectrometric Methods for Drug Target Identification by Thermal Proteome Profiling. J Proteome Res. 2023;22(8):2629-2640. doi:10.1021/acs.jproteome.3c00111

  
  

• [8] Song J. Applications of the Cellular Thermal Shift Assay to Drug Discovery in Natural Products: A Review. Int J Mol Sci. 2025;26(9):3940. Published 2025 Apr 22. doi:10.3390/ijms26093940

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