邻近标记技术演进简史：推动蛋白质互作研究的革命性工具

BioID一经问世，便因其独特的优势受到追捧。它最大的好处是“温和”，整个标记过程在活细胞内进行，无需添加任何有毒试剂，能最大限度地保留蛋白质的天然互作环境。此外，生物素-链霉亲和素的结合异常牢固，使得后续可以用非常严苛的条件清洗样本，有效去除背景干扰，因此信噪比通常不错。

然而，它的缺点也同样致命——太慢了。BioID完成一次充分的标记，通常需要18到24小时。这就像用相机进行一次超长时间的曝光，虽然能记录下POI在一天内的所有“历史访客”，却完全无法捕捉到那些稍纵即逝的动态变化。后来出现的BioID2虽然体积更小、效率稍高，但仍未从根本上解决时长问题。

为了解决BioID的时间分辨率问题，科学家们将目光投向了另一类酶——过氧化物酶。APEX（抗坏血酸过氧化物酶）最初是为电子显微镜成像而开发的。它的工作机制截然不同：在过氧化氢（H₂O₂）存在的条件下，APEX能催化底物生物素-苯酚，产生寿命极短（<1毫秒）但反应活性极高的生物素-苯氧基自由基。这些自由基几乎在产生的瞬间就会攻击周围富含电子的氨基酸残基（主要是酪氨酸），完成标记。

APEX的杀手锏是“快”。它的标记时间可以缩短到1分钟以内，实现了从“历史记录”到“瞬间快照”的飞跃，这使得研究快速的细胞信号转导等动态过程成为可能。其后续升级版APEX2进一步提高了灵敏度，对低表达蛋白更加友好。

但天下没有免费的午餐。APEX的致命弱点在于它依赖H₂O₂，而H₂O₂对细胞具有潜在的毒性和氧化应激效应，可能会干扰细胞正常的生理状态，甚至“杀死”你正在研究的对象。这使得APEX在活体动物中的应用受到很大限制，实验条件的优化也变得尤为苛刻。

研究者们渴望一种既有APEX的速度，又兼具BioID的温和的工具。答案来自强大的“定向进化”技术。2018年，科学家通过酵母展示平台，对BirA酶进行了多轮筛选和改造，最终创造出了催化效率极高的突变体——TurboID及其“迷你版”miniTurbo。

TurboID的催化效率比BioID高出数百倍，仅需10分钟就能达到甚至超过BioID标记18小时的水平，而且完全不需要H₂O₂。这一突破性进展，使其迅速成为邻近标记领域的“新宠”，被广泛应用于从细胞到线虫、果蝇乃至小鼠等多种模式生物中。

TurboID的优势显而易见：快速、温和、适用范围广。然而，极高的活性也带来了一些“甜蜜的烦恼”。首先是背景偏高，由于酶活性太强，即使不额外添加生物素，它也能利用培养基中微量的内源性生物素进行标记，导致“泄漏”信号增加。其次，长时间或高水平表达TurboID也可能对细胞产生一定的毒性。因此，精确控制标记时间、表达水平和生物素浓度，成了TurboID实验成功的关键。

随着标记酶的迭代，实验设计本身也在不断进化。为了解决融合蛋白可能影响POI功能的问题，研究者开发了Split-TurboID。它将TurboID酶一分为二，分别与两个可能互作的蛋白融合。只有当这两个蛋白相遇时，分裂的酶才能重组并恢复活性，从而实现对特定互作事件的超高特异性标记。

更有创意的ProtA-Turbo技术，则完全摆脱了基因改造的束缚。它将TurboID与能结合抗体的Protein A融合，形成一个“即用型”的酶。实验时，只需用特异性抗体靶向内源性蛋白，再加入ProtA-Turbo，就能对目标进行原位标记。这为在原代细胞或临床样本等难以进行基因编辑的系统中使用PL技术打开了大门。

早期的PL数据分析，主要依赖于对整个生物素化蛋白的富集，然后通过与阴性对照（如仅表达标记酶）进行定量比较，筛选出富集倍数高的蛋白。这种方法虽然直观，但容易引入假阳性——那些与生物素化蛋白紧密结合、但在纯化过程中被“顺便”一起拉下来的未标记蛋白。

如今，更先进的策略是进行肽段层面的富集（peptide-level enrichment）。即在质谱分析前，直接富集那些带有生物素标记的肽段。这种方法能直接鉴定出发生生物素化的确切位点，为“POI与该蛋白确实在空间上邻近”提供了最直接的证据，极大地提高了数据的可信度，并有效过滤了大量背景噪音。

小结

邻近标记技术的发展，是一部不断追求更高时空分辨率、更低细胞干扰、更强信噪比的创新史。从BioID的温和慢热，到APEX的迅猛激进，再到TurboID的均衡强大，每一步进化都为我们揭示细胞内分子世界的奥秘提供了更锐利的武器。希望这篇简史能帮助你更好地理解并驾驭这一强大的实验工具。

谱度众合是一家由武汉大学博士团队创办的科研服务企业，我们专注于利用质谱技术服务于生物标志物、药物靶点筛选、基础研究等蛋白质研究领域，我们在本专业细分领域持续深耕十几年，针对具体研究场景开发多种面向具体研究目的和论文发表需求的服务产品，助力于客户更轻松更高效的完成科研目标。

参考资料

1.Roux, et al. (2019). BioID: A Method to Generate a History of Protein Associations. *Methods Mol Biol*.

2.Ting, et al. (2018). Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. *Nat Biotechnol*.

3.Mulcahy.(2019). Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping. * F1000Res *.

4.Kim, et al.(2025). Bridging molecular and cellular neuroscience with proximity labeling technologies. * experimental & molecular medicine *.

5.Roux, et al. (2020). Comparative Application of BioID and TurboID for Protein-Proximity Biotinylation. *Cells*.

6.Mierlo, et al. (2021). Off-the-shelf proximity biotinylation for interaction proteomics. *Nature Communications*.

7. Ting, et al. (2020). Split-TurboID enables contact-dependent proximity labeling in cells. *PANS*.

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