已知药物表型，不知道靶点：选LiP-MS、TPP，还是 Pull down？
所属分类： 技术干货
发布时间： 2026-10-20
概要： 表型之后，靶点何在？表型筛选这几年回潮，原因大家都懂 —— 在完整细胞或在体系统里看整体效应，天然产物和全新机制先导物经常是这么捞出来的。
表型筛选这几年回潮，原因大家都懂 —— 在完整细胞或在体系统里看整体效应，天然产物和全新机制先导物经常是这么捞出来的。但好处也是代价：你看到了表型，却不知道药在哪个蛋白上起作用。这个从表型倒推靶点的过程叫靶点解卷积（Target Deconvolution），行内把它叫做药物研发的“死亡之谷”。
没有靶点，后面全卡住：药物化学家做不了基于结构的理性设计（SBDD），毒理团队预判不了脱靶风险（Off-target liabilities），临床转化也因为作用机制（MoA）不清而悬着。过去二十年，高分辨质谱支撑的化学蛋白质组学（Chemoproteomics）成了过这个谷的主力工具，路线分两派：要对小分子做化学修饰的标记策略（Affinity Pulldown、PAL-MS、ABPP），和不动化合物本身的无标记策略（TPP、LiP-MS、DARTS）。下面就把这三条主流路线的物理原理、实验协议、数据算法和实际盲区讲清楚。
一、基于探针的标记策略：亲和富集与光亲和标记
1. 亲和富集（Pull-down）：高富集效率与非特异背景的博弈
作为靶点发现领域长期沿用的经典范式，亲和富集（Affinity Pull-Down MS）直接基于分子间亲和力捕获靶蛋白。将小分子药（Bait）通过连接臂（Linker）固定在琼脂糖微球或磁珠上，与天然细胞裂解液孵育后，结合蛋白（Prey）被特异性富集，洗涤去除非特异结合物，洗脱后送高分辨液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定。
它最大的优点就是富集效率高、信噪比好。对于解离常数在纳摩尔到低微摩尔级别的中等偏强结合，Pulldown能直接把靶蛋白连同整个复合物一起拽出来。
但做过的人都知道，真正花时间的不是拉靶蛋白，而是压背景。三个最常见的坑：
高丰度蛋白（核糖体蛋白、分子伴侣、细胞骨架蛋白）天生爱贴珠子和连接臂，不管你药是什么，它们都在；
只做药珠vs空珠对比，出来的候选列表能有几百个，根本没法看；
没有竞争对照，你根本分不清“真结合”和“刚好贴在珠子上”。
所以严谨的实验设计必须至少带两组对照：
❶ 游离化合物竞争组：孵育时加过量游离药，真靶点信号会被竞争下去；
❷ 空载体对照组：只有珠子、没有药，看非特异贴珠蛋白。
数据出来之后，不要只看差异倍数。把质谱结果跟CRAPome（Affinity Purification污染数据库）比对，再用SAINTexpress这类统计算一遍，通常保留SAINT probability > 0.9且Fold-change > 2的蛋白，候选列表才敢往后续验证送。
常规洗涤条件会破坏跨膜结构域。现在比较成熟的做法是把亲和富集和Nanodisc或者SMA（苯乙烯-马来酸）聚合物膜模拟体系结合起来，在天然脂质微环境里做亲和选择质谱（ASMS），这是近年膜蛋白靶点解卷积一个比较实在的突破方向。
图1 Affinity Pull-down-MS 的一般流程：诱饵固定 → 孵育 → 洗涤 → 洗脱 → LC-MS/MS 鉴定
2. 光亲和标记（PAL-MS）：原位捕获瞬时相互作用的代价与边界
Pulldown存在天生的短板：
洗涤步骤猛，低亲和力、瞬时结合的靶点在洗涤过程中失效。要捕获这类相互作用，需要使用光亲和标记（Photoaffinity Labeling, PAL-MS）。
PAL给小分子装两个部件：
一个光反应基团，一个生物正交标签（炔基或叠氮）。探针进活细胞或裂解液、插入结合口袋里之后，使用350–365 nm紫外光照射 —— 光反应基团瞬间生成高活性中间体，跟旁边的蛋白形成不可逆共价键。后面再用CuAAC点击化学用生物素标记，链霉亲和素磁珠富集，这样形成的共价连接在SDS条件下依然稳定。
光反应基团的选择是探针设计里易被忽视的一点：
双吖丙啶（Diazirine）：
体积小，对药物原始活性影响小，微秒级激活，能直接插入邻近C-H键，目前最常用；
二苯甲酮（Benzophenone）：
激发波长更温和、交联产率高，但体积大，很容易把本来的结合亲和力破坏掉。
配合Dexter能量转移机制（如microMap技术），PAL信号还能做催化放大。
但PAL不是万能的：
光异构化和标记效率低是常态，有些探针照完交联率还不到10%；
最根本的门槛——你必须先合成探针。任何连接臂、光反应基团的引入都可能改变化合物的构效关系（SAR），万一探针活性丢了，这个项目就白做了。
这就是为什么当你的分子是个没SAR数据的片段化合物、极易失活的天然产物，或者压根不知道连接臂能往哪儿接的“盲盒”苗头化合物时，标记路线走不通，必须转向无标记方法。
二、无标记策略（一）：热蛋白质组分析（TPP）捕捉热力学稳定性变化
1. 生物物理基础：配体结合如何提高表观熔解温度
热蛋白质组分析（Thermal Proteome Profiling, TPP）的底子是CETSA（细胞热位移分析）。物理图像很简单：蛋白加热到一定温度会变性、疏水内核暴露、聚集沉淀；如果小分子药物坐在结合口袋里，整个复合物的自由能降低，表观熔解温度Tm就会升高。
TPP把CETSA和定量蛋白质组学拼在一起，有两种基本实验模式：
① TPP-TR（Temperature Range）：
固定一个药浓度，跑一串温度梯度，看哪些蛋白的熔解曲线发生了位移；
② TPP-CCR（Concentration Range）：
固定一个变性温度，跑一串药浓度，做剂量-反应曲线。
除了靶蛋白本身，药物引起下游复合物状态改变的效应蛋白也可能表现出热稳定性变化 —— 这是TPP能给系统生物学层面信息的原因。
图2 TPP 的三种实验模式：TPP-TR（温度梯度）、TPP-CCR（浓度梯度）与 2D-TPP
2. 通量优化：从温度梯度TPP到积分溶解度PISA
原版TPP有个现实问题 —— 耗机时。每个样品要在10个左右的温度点分别离心、分别制备、分别上机，TMT试剂和质谱机时都烧得很厉害。
PISA（Proteome Integral Solubility Alteration）是个很巧妙的改进：加热之后，把不同温度点离心得到的可溶蛋白组分等比例混成一个样品再打质谱。用溶解度的积分变化代替逐点拟合，靶点识别能力跟TPP高度一致，但样品通量至少提了一个数量级。配合AutoPELSA这类自动化样本制备系统，PISA才真正适合大规模化合物库的靶点筛选。
3. 统计模型演进：从S型拟合到非参数曲线比较（NPARC）
TPP数据是多维、非线性的。早期大家习惯拿一条S型（Sigmoidal）方程去拟合每个蛋白的熔解曲线，提取一个ΔTm。但这种刚性假设对很多复杂蛋白 —— 多结构域激酶、大型膜蛋白 —— 根本不适用，它们的曲线本身就是不规则的，硬拟合出来的Tm没有意义。
EMBL等机构推的NPARC（Non-parametric analysis of response curves）走的是另一条路：
不预设曲线形状，用函数型数据分析（FDA）拟合平滑基函数；
直接比较处理组和对照组在整个温度区间的曲线整体差异，算残差平方和（RSS）；
配合高斯过程回归（如GPMelt）和置换检验（Permutation test）控制FDR。
这套方法的价值在于：
大量以前被判为“不可拟合”的复杂曲线重新进入候选视野，假阴性明显下降。
4. 方法学盲区：热力学假阴性与膜蛋白增溶困境
热力学假阴性：
如果药物结合没有引起靶蛋白整体稳定性的显著变化，或者结合能太小、不足以对抗高温解折叠，TPP根本看不到它。阴性≠不结合。
不能用SDS：
加热变性这一步要求蛋白保持天然折叠，裂解缓冲液里严禁强变性剂。研究膜蛋白只能用温和去垢剂（NP-40、DDM、Digitonin、Triton X-100）增溶；但去垢剂胶束环境本身会人工改变膜蛋白的热特性，有时会把药物结合引起的微小稳定性漂移整个掩盖掉。
三、无标记策略（二）：限制性酶解质谱（LiP-MS）读取结构可及性
1. 与TPP的正交维度：从热力学稳定性到构象动态
TPP看热力学稳定性，LiP-MS看的是另一个维度 —— 结构可及性（Structural Accessibility）。
它的基本假设是：小分子结合蛋白之后，不光在口袋里造成位阻，还会引起局部或全局构象变化，甚至触发远端变构效应。这些变化会被蛋白酶“读”出来。
图3 LiP-MS 工作流程：天然提取 → 药物/对照孵育 → Proteinase K 限制性酶解 → 变性后胰酶二次酶解 → MS 比较差异肽段（Schopper et al., Nat. Protoc. 2017）
2. 实验协议的精密性：为什么酶切条件必须苛刻
LiP-MS对操作精度要求很高，几个关键参数是死的，不能凭感觉调：
用非变性缓冲液提蛋白（典型配方含1 mM MgCl₂、150 mM KCl、100 mM HEPES），绝对不能让蛋白提前变性；
加广谱蛋白酶K（Proteinase K, PK）做限制性酶解，酶:总蛋白底物通常控制在1:100；
25℃精确孵育5分钟，然后立刻99℃加热5分钟让PK瞬间失活——时间差个一两分钟，批次间重现性就垮了；
之后再加变性剂，用胰蛋白酶（Trypsin）做完全酶解，把蛋白打成适合质谱分析的短肽。
PK专切表面柔性高、溶剂可及性强、没形成稳定二级结构的环区和无规卷曲。药物坐在口袋里，要么把原来暴露的酶切位点保护起来，要么把原来埋着的疏水残基暴露出来 —— 这两种变化都会反映在肽段的丰度上。
最终追踪到的“LiP特征肽段”（Differential peptides）不光能告诉你靶蛋白是谁，还能在氨基酸序列水平上画出药物引起结构变化的精细图谱（Structural Footprinting），直接用来预测结合口袋的位置。这是LiP-MS相对TPP最大的空间分辨率优势。
3. 方法学谱系：从DARTS的凝胶条带到LiP-MS的肽段图谱
做化学生物学的人都听过DARTS（Drug Affinity Responsive Target Stability）。原理跟LiP-MS是近亲 —— 药物结合让靶蛋白对蛋白酶（Pronase、Subtilisin这类广谱酶）降解产生抵抗力。
但传统DARTS靠SDS-PAGE看完整条带的保护，或者切胶打质谱。问题很现实：
裂解液极复杂，低丰度靶蛋白的微弱保护信号被高丰度背景蛋白整个盖住；
分辨率停在完整蛋白条带水平，通量和统计效力都很有限。
LiP-MS本质上就是DARTS在高分辨DIA蛋白质组学时代的终极形态 —— 扔掉凝胶，直接在肽段层面做全蛋白质组扫描，从宏观的“降解抵抗”跨到微观的“多位点构象动态”。
4. 计算瓶颈：半特异性肽段搜库与蛋白丰度协变量校正
LiP-MS最近两年应用爆发，一半功劳在DIA（Data-Independent Acquisition）和下游算法。
原因是样品里的肽段不全是规整的胰酶肽：PK非特异性切一刀、胰酶再切一刀，会产生大量“半特异性肽段”（Half-tryptic / Semi-tryptic peptides）——一端符合胰酶切位，另一端是PK乱切的。
传统DDA模式处理这种数据会出三个问题：采样随机、FDR失控、缺失值多。
现在主流的解法是：
Biognosys Spectronaut 的 directDIA+ 无库搜库：用机器学习直接从DIA数据里识别半特异性肽段，对激酶ATP结合口袋这类药物结合区域的肽段回收率提升明显；
开源阵营里，MSFragger + FragPipe-Analyst 通过优化诱饵库生成和特征选择，对半特异性搜索空间做精确FDR控制；DIA-NN也已经全面支持semi-tryptic检索。
还有一个容易被忽视的统计问题：LiP信号里存在蛋白表达量本身变化造成的假阳性。
单独设置一组仅用胰酶完全酶解的对照作为协变量，对每个半特异性LiP肽段做蛋白丰度层面的基线校正，再做对比模型推断，最后输出反映构象变化的结构域图谱。
图4 LiP-MS 数据专用分析流程：先剥离蛋白丰度差异，再做对比模型推断，定位结构可及性变化（LiPAnalyzeR 框架）
四、正交联合范式：四象限判读与假阴性风险对冲
我一般不建议客户在TPP和LiP-MS之间二选一。它们测的物理量是正交的：
TPP测宏观热力学——蛋白复合体在热变性中的总自由能变化，能捕捉到下游通路的效应蛋白；
LiP-MS测常温下的微观结构——局部位阻、柔性变化、变构位点，对直接结合口袋解析力更强。
把同一份药物处理的天然样品一分为二，平行跑TPP和LiP-MS，出来的结果可以排成一个四象限，直接指导后续验证策略：
❶ LiP-MS(+) / TPP(+)：最高置信度的直接靶点。药物既在口袋里造成了局部结构闭合，又整体提升了热力学稳定性，后面验证基本不会翻车；
❷ LiP-MS(+) / TPP(-)：提示瞬时结合、低亲和力但足以诱导局部重排的相互作用，或者远端变构位点——这类靶点用Pulldown根本抓不到，LiP-MS是最敏感的；
❸ LiP-MS(-) / TPP(+)：热力学稳定了，但常温下结合位点周围没有PK能切的柔性环，常见于多结构域蛋白的深埋刚性口袋。
一个表型很好的分子，如果TPP和LiP-MS都阴性，先不要急着否定分子本身——可能是靶点属于上面提到的LiP盲区（深埋刚性口袋），也可能是TPP盲区（结合不改变整体稳定性）。这时候要回去想：是不是该尝试探针路线，或者换细胞模型、换孵育条件。单次阴性结果就枪毙一个先导物，是靶点项目里最常见也最贵的错误。
五、方法选择决策树与无标记三路线对照
1. 两步决策：从分子可修饰性到实验核心诉求
第一步：这个分子能不能做化学修饰？
能修饰、且合成探针后活性保留 → 优先 Affinity Pulldown 或 PAL-MS。富集方法背景最低、直接结合证据最硬；如果结合亲和力特别弱，可以叠TurboID这类邻近标记放大瞬时互作信号。
不能修饰（天然产物、片段苗头、盲盒化合物）→ 走无标记路线，进第二步。
第二步：你的核心诉求是什么？
要定位结合口袋、要推导构象机制、要服务后续分子对接和先导物优化 → 优先 LiP-MS。半特异性肽段图谱能在没有晶体结构的情况下直接给出响应结构域。
要在活细胞生理状态下确证靶点结合，或者要对先导物系列做高通量排序、筛化合物库 → 优先 TPP/PISA。TPP能在细胞膜完整的条件下做，对需要细胞内代谢激活的前药（prodrug）尤其重要；PISA适合大库筛。
2. TPP / PISA / LiP-MS 关键维度对照
结语
做过这么多靶点项目之后，我自己的判断是这样的：
任何一条路线都有系统性盲区，单平台阴性结果不能直接下结论；
化学合成资源充足、分子SAR清楚，先做探针Pulldown/PAL，拿到一锤定音的直接结合证据，后面所有验证都顺；
分子不能动（天然产物、片段、盲盒苗头），就TPP和LiP-MS正交做，一个看热力学、一个看结构可及性，互相补盲；
膜蛋白项目，提前在预算里留出增溶体系优化和Nanodisc/SMA的钱，不要等到数据出来信号弱再补救。
质谱灵敏度和DIA算法这几年确实进步很快，但靶点解卷积这个活儿，技术只是一半，另一半是你在设计实验之前，愿不愿意花半小时把“这个分子可能的盲区在哪里、阴性结果怎么解释”想清楚。
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关键词： 已知药物表型，不知道靶点：选LiP-MS、TPP，还是 Pull down？
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