LiP-MS和传统的药物靶点筛选有哪些差别
所属分类： 技术干货
发布时间： 2026-09-11
概要： 药物靶点筛选技术怎么选？LiP-MS相较于化学蛋白质组学、ABPP、DARTS、CETSA / TPP等技术的区别在哪里？
写在前面
去年有个做天然产物的朋友找我，手里一个小分子细胞表型很漂亮，IC50不到200 nM，但就是不知道靶点是谁。他先试了最经典的办法 —— 化合物做生物素标记然后pull-down。结果探针合成花了一个半月，标记后活性掉了一大半，拉下来一堆杂蛋白，真靶点淹没在噪音里。
这种事我见得太多了。靶点筛选最让人头疼的从来不是质谱不够灵敏，而是前面的样品制备 ——化合物能不能修饰？修饰后活不活？洗涤强度怎么定？膜蛋白和低丰度蛋白怎么办？
后来我建议他试了有限蛋白水解质谱——LiP-MS。两周出结果，直接锁定靶点，还顺带给了结合区域。今天就把这项技术掰开讲清楚。
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一、LiP-MS到底是个什么技术？
1. 原理：用蛋白酶给蛋白构象"拍快照"
有限酶解：
在非变性的条件下，用低浓度的蛋白酶K（Proteinase K）对蛋白做短时间有限酶解——只切蛋白表面柔性、暴露的地方，内部紧密折叠的核心区域切不到。
药物影响：
小分子结合靶蛋白后，产生位阻效应或构象改变，蛋白酶K在结合区域附近的切割效率受到影响。
差异检测：
加药组和对照组在同样条件下酶解，产生的肽段种类和丰度不一样。找出差异肽段，对应的蛋白就是候选靶点。
💡 打个比方
把折叠的蛋白质想象成一个揉成团的纸团，蛋白酶K只能碰到露在外面的角。纸团形状变了，露在外面的角就变了。LiP-MS检测的，就是这个"露在外面的角"的变化。
为什么用蛋白酶K而不是胰蛋白酶？因为胰蛋白酶只在Lys/Arg后面切，切割位点太有偏向性，很多结合区域附近没有Lys/Arg就检测不到信号。蛋白酶K是序列非特异性的，能更均匀地采样蛋白表面。
图1. LiP-MS实验工作流程。两种条件下的天然蛋白分别经过有限酶解（LiP）和完全胰酶消化（TrP），结构特异性肽段通过质谱定量比较。（图源：Schopper et al., Nature Protocols, 2017）
2. 标准流程5步走
① 天然蛋白提取：
用温和裂解液（不含SDS/尿素）在非变性条件下提蛋白，保持天然构象。用RIPA裂解液是大忌——里面的SDS会让蛋白变性。
② 化合物孵育：
蛋白分两组，加药组和DMSO对照组，25°C或37°C孵育让小分子充分结合。建议设高低两个浓度。
③ 有限酶解：
加蛋白酶K，酶底物比通常1:100到1:1000（w/w），反应1-5分钟后立即加变性剂终止。时间精确到秒，加酶和终止顺序在两组间交叉进行。
④ 完全胰酶消化：
变性后用胰蛋白酶37°C消化过夜（约16h），把所有蛋白切成标准肽段。此时样本中同时存在LiP肽段（非胰酶切）和TrP肽段（标准胰酶切）。
⑤ 质谱分析：
高分辨质谱（Orbitrap）DDA/DIA采集，用TrP肽段归一化LiP肽段，比较组间差异。推荐用Picotti团队的R包protti或Spectronaut。
这项技术由ETH Zürich的Paola Picotti团队在2014年正式提出（Feng et al., Nature Biotechnology），2017年在Nature Protocols发表详细方案，至今仍是很多实验室的操作蓝本。
二、传统靶点筛选方法，各自有什么硬伤？
1. 化学蛋白质组学 / Pull-Down
最经典的方法：化合物连生物素或点击化学手柄，孵育后用链霉亲和素磁珠钓出结合蛋白。
化合物修饰难：
约15%-20%的小分子标记后活性丧失或大幅下降；有些化合物的活性基团就是药效团，根本没法修饰。
合成周期长：
设计连接臂、选修饰位点、验证活性，顺利两三周，不顺利两三个月。
洗涤条件难定：
洗太狠真靶点被洗掉，洗太轻一堆高丰度杂蛋白（肌动蛋白、伴侣蛋白等）混进来，全靠经验。
2. ABPP（活性探针技术）
用带反应基团的活性探针共价标记特定酶类的活性位点。优势是能直接反映酶活性状态，但天生局限——只覆盖有已知活性化学反应的酶类（丝氨酸水解酶、半胱氨酸蛋白酶、激酶等），结构蛋白、受体、其他蛋白抓不到。
3. DARTS
2009年开发，原理和LiP-MS几乎一样——小分子结合保护蛋白不被蛋白酶降解。但DARTS用链霉蛋白酶，检测靠SDS-PAGE或Western blot，本质是"候选蛋白验证工具"，做不了全蛋白质组无偏筛选。LiP-MS相当于DARTS的高通量、高分辨率升级版。
4. CETSA / TPP
目前最主流的无标记方法。原理：配体结合通常增加蛋白热稳定性（Tm升高），通过温度梯度比较可溶性蛋白量变化找靶点。CETSA最初用Western blot，和质谱结合后就是TPP，可一次检测几千个蛋白。
图2. 热蛋白质组分析（TPP）工作流程。温度梯度处理后比较可溶性蛋白组分，鉴定热稳定性改变的靶蛋白。（图源：Creative Proteomics）
分辨率不够细：
TPP只能在蛋白水平上指出结合，但具体结合在哪个区域，说不清。LiP-MS就完全不同，它能精确检测到肽段水平，有时候直接把结合位点锁定到十几个氨基酸都是有可能的。
部分结合无热位移：
有差不多20%-30%的真实靶点不引起显著热位移，可能会在TPP中被漏掉。
样本消耗大：
标准TPP流程需要设置8-10个温度点，加重复一次实验二三十个样本，检测时长和样本制备的工作量都不小。
三、LiP-MS的核心优势在哪？
1. 不需要修饰化合物
这是最大的门槛降低。化学蛋白质组学的探针合成可能花1-3个月，还有相当比例的化合物做不了探针。LiP-MS完全跳过——拿到什么化合物直接加到裂解液里，原封不动。对做天然产物的实验室尤其关键，很多天然产物结构复杂、活性基团不明确，化学修饰很难。
2. 肽段级分辨率
TPP告诉你靶点是谁，LiP-MS还能告诉你结合在哪个区域。差异肽段如果在加药后丰度下降（被保护），所在区域很可能就是结合位点附近。这个信息对后续共结晶、冷冻电镜、分子对接都极有价值。我有个项目，LiP-MS筛出的激酶靶点，差异肽段正好落在ATP结合口袋附近，后来SPR验证Kd在纳摩尔级。
3. 能捕捉变构效应
很多小分子不是直接占据活性位点，而是结合变构位点通过远程构象传递调节功能。LiP-MS能同时看到结合位点附近的保护信号和远端区域的构象变化信号，甚至能重建变构通讯路径。做变构调节剂的课题组，这个能力是独一无二的。
4. 一张表看清楚各方法差异
表1. 主流药物靶点筛选方法对比
四、做LiP-MS，这些坑我替你踩过了
1. 蛋白酶K条件优化是"玄学"核心
最关键的参数不是质谱分辨率，而是蛋白酶K的浓度、时间和温度。我一般先做预实验：设3-4个浓度梯度（1:50到1:5000），跑SDS-PAGE看条带模式。
判断标准：酶解后所有条带消失变成smear——过度；条带和对照几乎一样——不够。最佳状态是介于两者之间，能看到明显条带变化但又不是完全降解。
2. 低丰度蛋白和膜蛋白是两大盲区
低丰度蛋白：
细胞内丰度前50%的蛋白检出率和可靠性不错；后30%的蛋白检出率明显下降，假阴性率升高。
膜蛋白：
需要去垢剂溶解，但去垢剂影响蛋白酶K活性和质谱分析。多次跨膜蛋白尤其困难。
如果靶点预计是低丰度转录因子或膜蛋白，LiP-MS可能筛不到，需要考虑靶向富集或换用TPP in-cell格式。
3. 假阳性和假阴性必须警惕
批次效应：
不同批次间蛋白构象波动会产生假差异。至少3次生物学重复，FDR<0.01加fold change>2。
间接效应：
激酶抑制剂加药后引起下游磷酸化级联反应，很多差异蛋白是间接效应不是直接靶点。做剂量响应——直接靶点低浓度就有信号。
化合物非特异性：
高浓度下化合物非特异性结合或引起蛋白聚集。至少做高低两个浓度，只有剂量依赖的才是高置信候选。
4. 数据分析不是点一下按钮
LiP-MS需要同时分析LiP肽段（非胰酶切）和TrP肽段（标准胰酶切），搜库要允许半胰酶甚至非特异性酶切，搜索空间大，FDR控制要更严格。推荐用Picotti团队开发的R包protti，或Spectronaut 14+的LiP-MS专门流程。
五、几个经典应用案例
① 雷帕霉素/FKBP12：
几乎每篇LiP-MS方法学论文都用它做验证。LiP-MS能特异性检测到FKBP12的酶解可及性变化，差异肽段落在结合口袋区域。还能检测到FKBP3/4/5等家族成员。
② 甲氨蝶呤/DHFR：
经典抗癌药，靶点DHFR。LiP-MS能稳定检测到DHFR显著差异，差异肽段定位在底物结合口袋附近。批间变异很小，常作为阳性对照。
③ 金丝桃素/Dlat：
天然产物，有调控棕色脂肪产热功效。LiP-MS找到直接靶点Dlat（二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶），后续敲除和突变实验验证了完整机制链。天然产物做探针合成很难，LiP-MS无需修饰的优势体现得淋漓尽致。
④ 激酶抑制剂脱靶/FECH：
LiP-MS筛选多种激酶抑制剂发现FECH（亚铁螯合酶）是共同脱靶蛋白，解释了临床上一些激酶抑制剂的光敏性副作用。先导化合物优化阶段做一次LiP-MS脱靶筛选，能提前发现安全性问题。
图3. LiP-MS的主要应用场景：药物靶点解析、蛋白质降解、结构变化、配体发现。（图源：ETH Zürich / Aleš Holfeld）
六、什么时候该用LiP-MS？什么时候该用别的？
优先选LiP-MS
化合物结构复杂、难以修饰，或修饰后活性不确定
需要知道结合区域，为后续结构生物学研究提供方向
怀疑作用机制涉及变构调节
需要2-4周内快速拿到候选靶点列表
靶点预计是中高丰度可溶性蛋白
优先选TPP/CETSA
需要在活细胞水平验证靶点结合（in-cell CETSA）
需要做剂量响应曲线评估亲和力（TPP-CCR成熟）
实验室已有TPP平台，不想再建LiP-MS方法
优先选化学蛋白质组学
化合物有明确可修饰位点且修饰后活性保持良好
需要极高灵敏度抓低丰度靶点（富集效应显著）
化合物是共价抑制剂（竞争性ABPP对共价结合非常特异）
需要活细胞内原位标记
写在最后
做了20年蛋白质组学，最深的体会是：没有最好的技术，只有最合适的技术。LiP-MS把结构生物学从单蛋白带到了全蛋白质组水平，但它不是万能的——低丰度蛋白、膜蛋白、数据分析复杂性，都是需要克服的挑战。
大家做靶点筛选，尤其是遇到不适合进行修饰的化合物、或者说需要快速出结果，强烈建议试一试LiP-MS。但记住，任何筛选结果都需要正交验证：SPR/ITC结合验证、细胞功能实验、位点突变验证，一步都不能少。
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主要参考文献
1. Feng Y, et al. Measuring protein structural changes on a proteome-wide scale using limited proteolysis-coupled mass spectrometry. Nat Biotechnol, 2014, 32(10): 1036-1044.
2. Schopper S, et al. Measuring protein structural changes on a proteome-wide scale using LiP-MS. Nat Protoc, 2017, 12(11): 2391-2410.
3. Molina DM, et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using CETSA. Science, 2013, 341(6141): 84-87.
4. Savitski MM, et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science, 2014, 346(6205): 1255784.
5. Lomenick B, et al. Target identification using DARTS. PNAS, 2009, 106(51): 21984-21989.
6. Quast JP, Schuster D, Picotti P. protti: an R package for comprehensive data analysis of peptide- and protein-centric bottom-up proteomics data. Bioinformatics Advances, 2022, 2(1): vbab041.
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